Skip to content

Retencja CXCR4 w retikulum endoplazmatycznym blokuje rozprzestrzenianie się hybrydomy komórek T. czesc 4

2 miesiące ago

742 words

Pokazane są dwa reprezentatywne klony na cztery. Wiązanie 125I-SDF z klonami SDF-1-KDEL w porównaniu z komórkami TAM2D2 i komórkami kontrolnymi transfekowanymi wektorem. Pokazano jeden reprezentatywny eksperyment na trzy. Wybraliśmy klony o wysokim poziomie ekspresji przez sortowanie pojedynczych komórek FACS, w oparciu o ich ekspresję EGFP (Figura 1b). Pokazano wyniki uzyskane dla dwóch wybranych klonów (SDF-K7 i SDF-K17), ale inne klony zachowywały się podobnie. Aby zbadać, czy konstrukt SDF-1-KDEL zmniejszył poziomy powierzchni CXCR4, przeprowadzono test wiązania z znakowanym 125I SDF-1. Jak pokazano na Figurze 1c, klony SDF-K7 i SDF-K17 praktycznie nie wiązały się z SDF-1. Migracja transfektantów SDF-1-KDEL. Utratę receptora SDF-1 na powierzchni komórki klonów SDF-K7 i SDF-K17 potwierdzono przy użyciu testu chemotaksji. Komórki TAM2D2 w ogóle nie migrują, gdy w niższym przedziale nie ma chemokiny, ale bardzo silnie reagują na chemokinę SDF-1. Podczas gdy SDF-1 jest silnym atraktantem dla nietransfekowanych komórek TAM2D2 i pustych wektorów transfektantów, dwa klony SDF-K7 i SDF-K17 w ogóle nie migrowały (Figura 2). Podobne wyniki uzyskano dla innych klonów (dane nie pokazane). Aby pokazać specyficzność tego efektu, przeprowadziliśmy test chemotaksji z inną chemokiną: grasicą i chemokiną regulowaną aktywacją (TARC) (32). Migracja w kierunku TARC była taka sama jak w przypadku nietransfekowanych komórek TAM2D2 i pustych wektorów transfektantów (Figura 2). To pokazuje, że na zdolność migracji komórek nie ma ogólnie wpływu, ale że reakcja na SDF-1 jest szczególnie upośledzona. Rysunek 2 Migracja w kierunku SDF-1 i TARC transfektantów SDF-1-KDEL. Dane są wartościami procentowymi komórek, które migrowały w ciągu 2 godzin przez filtr do dolnej komory trans- wietrznej zawierającej 100 ng / ml chemokiny. Dane to średnie. SEM z trzech przeprowadzonych eksperymentów. Inwazja transfektantów SDF-1-KDEL. We wcześniejszych badaniach zaobserwowano ścisłą korelację między rozprzestrzenianiem in vivo komórek hybrydoma T a inwazją in vitro w monowarstwy zarodkowych fibroblastów (4-7). Dlatego ten test inwazji wydaje się być odpowiednim modelem do badania szlaków transdukcji sygnału zaangażowanych w rozprzestrzenianie. Zarówno inwazja, jak i rozsiew są zależne od białek Gi, ponieważ oba zostały całkowicie zahamowane przez toksynę krztuśca (5, 6). Oznacza to, że zaangażowany jest receptor sprzężony z białkiem G, najprawdopodobniej receptor chemokinowy. Embrionalne fibroblasty stosowane w teście inwazji eksprymują chemokinę SDF-1 w sposób podobny do komórek w wielu tkankach in vivo (17). Dlatego wydawało się możliwe, że CXCR4 odgrywa rolę w inwazji hybrydomy komórek T. Rzeczywiście, inwazja dwóch klonów była całkowicie zablokowana (ryc. 3). Aby ponownie wykluczyć możliwość bardziej ogólnego efektu, zbadaliśmy, czy wyzwalanie innego receptora chemokin może przywrócić zdolność inwazyjną. Monowarstwę z REF poddano wstępnej obróbce przez 2 godziny za pomocą TARC. To zwiększyło inwazję komórek kontrolnych z 30. 40% do 35. 45% dodanych komórek. Podobnie, inwazja klonów SDF-K7 i SDF-K17 wzrosła z 0 do 6% dodanych komórek. To pokazuje, że zdolność inwazyjna klonów nie jest zablokowana, chociaż TARC jest najwyraźniej mniej skuteczny w indukowaniu inwazji niż SDF-1. Efekt transfekcji SDF-1-KDEL jest zatem specyficzny dla CXCR4, pokazując, że inwazja zależy całkowicie od liganda SDF-1. Figura 3 Inwazja klonów SDF-1-KDEL do monowarstw REF, wstępnie traktowanych lub nie traktowanych wstępnie 100 ng / ml TARC. Dane to procent komórek, które zaatakowały w ciągu godziny i są średnie. SEM z pięciu przeprowadzonych eksperymentów. Rozpowszechnianie transfektantów SDF-1-KDEL. Po ustaleniu, że indukowana przez SDF-1 (3 migracja i inwazja klonów SDF-K7 i SDF-K17 zostały całkowicie zablokowane, następnie testowaliśmy rozprzestrzenianie in vivo. Wstrzyknęliśmy 5 x 105 komórek do żył ogonowych nagich myszy. Krzywa przeżycia została przedstawiona na rycinie 4. Pięć myszy, którym wstrzyknięto puste transfektanty wektora, zmarło w ciągu 4 tygodni z tym samym schematem rozmieszczenia narządów, jaki obserwowano dla komórek TAM2D2 we wcześniejszych badaniach, tj. Masowej inwazji na wątrobę, śledzionę, nerki i jajniki (1, 2, 6). Przeciwnie, 18 z 19 myszy, którym wstrzyknięto jeden z dwóch transfektantów SDF-1-KDEL przeżyło 100 dni, a po badaniu makroskopowym i mikroskopowym nie stwierdzono żadnych nieprawidłowości. Tylko jedna mysz, której wstrzyknięto transfektant SDF-K7, była konająca po 8 tygodniach, ale nie wykryto nowotworu w śledzionie i nerce. Jednak duży guz został wykryty w zaotrzewnowym tłuszczu i małych guzach w obszarze wnęki wątroby
[hasła pokrewne: olej kokosowy na włosy jak stosować, poradnia osteoporozy warszawa, zioła na odchudzanie ojca klimuszko ]
[hasła pokrewne: bestia z wolfsberga cda, techniki relaksacyjne dla dzieci, zioła na odchudzanie ojca klimuszko ]