Skip to content

Retencja CXCR4 w retikulum endoplazmatycznym blokuje rozprzestrzenianie się hybrydomy komórek T. cd

2 miesiące ago

709 words

Komórki TAM2D2 transfekowano i sortowano FACS w celu selekcji objętościowej populacji o wysokiej ekspresji EGFP. Test wiązania. Komórki przemyto trzy razy chłodzonym lodem RPMI-1640 i ponownie zawieszono w RPMI-1640 uzupełnionym 1% BSA. Komórki (5 x 105) inkubowano w 4 ° C w różnych stężeniach 125I-SDF-1 (Amersham International, Little Chalfont, Wielka Brytania) rozcieńczonym 1:10 zimnym SDF-1. W celu pomiaru wiązania specyficznego dodano nadmiar zimna SDF-1. Po 30 minutach komórki przemyto czterokrotnie lodowatym RPMI-1640 uzupełnionym 1% BSA. Komórki zliczano za pomocą licznika gamma (Minaxis, Packard, Meriden, Connecticut, USA). Aspekcyjne wiązanie odjęto od całkowitego wiązania, aby obliczyć specyficzne wiązanie. Test migracji. Testy migracji przeprowadzono jak opisano wcześniej (6). W skrócie, przetoczenia z 8-. Metrowymi porami były blokowane przez 2 godziny za pomocą 0,5% albuminy jaja kurzego w temperaturze pokojowej. Dolną komorę wypełniono 250 ul SDF-1 lub grasicy i chemokiny regulowanej aktywacją (TARC) (PeproTech Inc., Rocky Hill, New Jersey, USA) przy 100 ng / ml w RPMI-1640 uzupełnionej 0,1% owalbumin. Transwell umieszczono na górze, a 105 komórek przemywano lodowato zimnym wolnym od surowicy podłożem dodawano do górnej komory. Po inkubacji przez 2 godziny w 37 ° C i 5% CO2 zliczono migrowane komórki w dolnej komorze. Test inwazji. Testy inwazji przeprowadzono jak opisano wcześniej (28). Pokrótce, konfluentne monowarstwy REF w 24-studzienkowych płytkach i transfektantach TAM2D2 przemyto, a te ostatnie dodano do monowarstw w pożywce bez surowicy. Po inkubacji przez godzinę w 37 ° C i 5% CO2, monowarstwy intensywnie przemyto i utrwalono 2% paraformaldehydem. Zajęte komórki zliczano za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. W niektórych doświadczeniach monowarstwy REF traktowano wstępnie 100 ng / ml TARC przez godzinę w 37 ° C, a następnie intensywnie przemywano przed dodaniem komórek TAM2D2. Rozsiewanie. Komórki TAM2D2 lub transfektanty (5 x 105) w 0,2 ml PBS uzupełnione mM CaCl2 i mM MgCl2 wstrzyknięto do żyły ogonowej syngenicznych 2- do 3-miesięcznych myszy AKR lub nagich myszy BALB / c. Sekcje zwłok wykonywano, gdy zwierzęta były konające lub po 100 dniach i badano makroskopowo i mikroskopowo pod kątem obecności przerzutów. Jako kontrolę wstrzyknięto podskórnie 106 komórek w celu określenia zdolności komórek do wzrostu in vivo. Jak tylko widoczny był mniejszy guz, zmierzono rozmiar guza, a następnie mierzono go kolejno co 2 dni w celu ustalenia szybkości proliferacji. RT-PCR. Narządy nagiej myszy BALB / c zamrożono w ciekłym azocie i całkowite RNA ekstrahowano przy użyciu Ultraspec RNA (Tel-Test Inc., Friendswood, Texas, USA). RNA (5 .g) poddano odwrotnej transkrypcji z użyciem starterów oligo-dT stosując system przedwzmacniacza Superscript (Life Technologies Ltd.). RT-PCR przeprowadzono na cDNA z różnych tkanek myszy za pomocą swoistych starterów SDF-1 (3. Amplifikacja RNA p-aktyny została przeprowadzona jednocześnie przy użyciu starterów specyficznych dla aktyny. Produkty amplifikowane (15 ul) poddano elektroforezie w 1,5% żelu agarozowym. Wyniki Redukcja powierzchni komórki CXCR4. Aby zbadać rolę CXCR4 w inwazji i rozprzestrzenianiu hybrydoma komórek T, użyliśmy. Intrakiny. podejście opisane poprzednio (23, 24) w celu zmniejszenia poziomów powierzchni komórkowej receptora chemokiny. To podejście obejmuje transfekcję liganda CXCR4 SDF-1 z dołączoną na końcu C sekwencją KDEL. Ta sekwencja KDEL wiąże się z receptorem KDEL w ER, a zatem zachowuje białka w ER. . Intrakine. SDF-1-KDEL wiąże się z nowo syntetyzowanym CXCR4, a tym samym zapobiega jego transportowi na powierzchnię komórki, co prowadzi do obniżenia poziomów powierzchni komórek CXCR4. Aby wybrać komórki o dostatecznie wysokiej ekspresji SDF-1-KDEL, użyliśmy wektora retrowirusowego, w którym IRES (31) był obecny poniżej cDNA SDF-1-KDEL, a następnie cDNA kodującego białko fuzyjne o oporności na higromycynę białko i EGFP. Zastosowane konstrukcje pokazano na rysunku 1a. Zarówno SDF-1-KDEL, jak i białko fuzyjne ulegają ekspresji z jednego bicistronowego mRNA, a poziomy ekspresji prawdopodobnie się korelują. Rycina Odwrót CXCR4 przy użyciu metody intrakiny. (a) Schematyczne przedstawienie wektorów ekspresyjnych. CDNA kodujący SDF-1 z C-końcową sekwencją KDEL wklonowano do wektora retrowirusowego pLZRS-IRES-Hyg-EGFP. Pusty wektor nie zawiera konstruktów SDF-KDEL, ale zawiera sekwencję IRES i cDNA kodujący białko fuzyjne oporności na hygromycynę – EGFP. (b) Analiza FACS ekspresji EGFP klonów SDF-1-KDEL. Wypełnione histogramy to poziomy EGFP, otwarte histogramy pochodzą od nietransfekowanej kontroli
[podobne: urolog dziecięcy rzeszów, techniki relaksacyjne dla dzieci, laserowe usuwanie zylakow ]
[hasła pokrewne: sukces definicja, marek kamiński blog, poradnia osteoporozy warszawa ]