Skip to content

Retencja CXCR4 w retikulum endoplazmatycznym blokuje rozprzestrzenianie się hybrydomy komórek T. ad

1 tydzień ago

637 words

Ponieważ hybrydomy komórek T wyrażają receptor chemokiny CXC 4 (CXCR4), receptor dla SDF-1 (21), badaliśmy, czy ten receptor jest zaangażowany w migrację in vivo tych komórek. Oprócz tego, że jest receptorem dla SDF-1, CXCR4 jest także koreceptorem dla HIV-1 (22). Jedną z metod proponowanych do hamowania infekcji komórek T przez HIV-1 jest obniżenie poziomów CXCR4 przez transfekcję SDF-1 połączonego z sekwencją KDEL sygnału retikulum endoplazmatycznego (ER), która jest zatrzymana w ER (23, 24). ). Nowo zsyntetyzowany CXCR4 wiąże się z tym SDF-1-KDEL, jest również zatrzymywany w ER, a zatem zapobiega dotarciu do powierzchni komórki. Rozpoczęto badania kliniczne, w których hematopoetyczne komórki macierzyste transdukowano dwiema intrakynami, SDF-1-KDEL i RANTES-KDEL (25), drugą skierowaną na drugi receptor HIV-1, receptor chemokiny CC 5 (CCR5) (26, 27). Zastosowaliśmy tę samą metodę w celu zmniejszenia poziomów powierzchni CXCR4 hybrydomy komórek T. Pokazujemy tutaj, że powoduje to całkowite zahamowanie inwazji in vitro i rozprzestrzenienie się w wielu tkankach in vivo. Metody Komórki. Mysią hybrydomę T komórki TAM2D2 wytworzono przez fuzję nieinwazyjnych komórek chłoniaka BW5147 z normalnymi aktywowanymi limfocytami T (1). Komórki hodowano w pożywce RPMI-1640 z L-glutaminą (Life Technologies Ltd., Paisley, Wielka Brytania) uzupełnionej 12,5 mM NaHCO3, 10 mM kwasem 4- (2-hydroksyetylo) -1-piperazynometanosulfonowym, 10% NCTC 135 ( ICN Pharmaceuticals Inc., Costa Mesa, Kalifornia, USA), 0,26 g / l L-glutaminy, 0,05 mM 2-merkaptoetanolu, 0,5 mM pirogronianu sodu, mM kwasu szczawiowo-octowego, 0,2 jm / ml insuliny bydlęcej, 100 jm / ml penicylina, 100 .g / ml streptomycyny (Life Technologies Ltd.) i 10% FCS (Life Technologies Ltd.) (4, 28). Transfektanty TAM2D2 hodowano w tej samej pożywce z dodatkiem mg / ml higromycyny (Calbiochem-Novabiochem Corp., La Jolla, Kalifornia, USA) lub 0,4 .g / ml puromycyny (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA). . Fibroblasty zarodkowe szczura (REF) hodowano w pożywce DMEM (Life Technologies Ltd.) z 10% nowonarodzoną surowicą cielęcą (Life Technologies Ltd.) i stosowano do testów inwazyjnych między pasażami 5 i 15. Generowanie i transdukcję konstruktów DNA. Konstrukt SDF-1-KDEL wytworzono przez PCR ze starterami (5a-TAGCTCTAGAGCCATGGACGCCAAG-3 (3 (do przodu) i 5 (3-TAGCGAATTCTTACAGCTCGTCCTTCTCGCTCTTGTTTAAAGCTTTCTCCAGG-3 (odwrotnie ze znacznikiem KDEL), jak opisali Chen i wsp. (23). Konstrukt został wklonowany do wektora retrowirusowego pLZRS-IRES-hyg-EGFP, który był oparty na wektorze pLZRS-IRES-zeo (29), w którym cDNA oporności na zeocynę zastąpiono cDNA kodującym wzmocnioną zieleń o wartości higromycyny. białko fuzyjne białka fuzyjnego (EGFP) (30) Wewnętrzne rybosomalne miejsce wejścia (IRES) umożliwia translację zarówno konstruktu KDEL, jak i białka fuzyjnego EGFP opornego na higromycynę z jednego bicistronowego mRNA (31), dlatego oczekuje się wysokiej ekspresji EGFP aby skorelować się z wysoką ekspresją konstruktu, wektor transfekowano przez wytrącanie fosforanem wapnia do linii komórek wirusa NXE (30), po 8 godzinach odświeżono pożywkę i 48 godzin później zebrano supernatant wirusa i przyzwyczajony zainfekować komórki TAM2D2. Trzy dni później dodano higromycynę, a po kilku dniach wybrane komórki sortowano za pomocą pojedynczych komórek FACS w celu wybrania klonów o wysokiej ekspresji EGFP. Jako kontrolę, pusty wektor pLZRS-IRES-hyg-EGFP również transfekowano do komórek TAM2D2. Konstrukt SDF (K1R) -KDEL został wygenerowany w następujący sposób. W celu otrzymania argininy zamiast lizyny jako pierwszego aminokwasu dojrzałego białka, A w pozycji 65 została zmutowana do G. Dla łatwiejszego klonowania wprowadzono mutację C. T w pozycji 84 w celu otrzymania miejsca Cla. Wprowadzenie mutacji przeprowadzono za pomocą PCR z użyciem starterów do przodu i do tyłu normalnego konstruktu SDF-1-KDEL i zmutowanych starterów 5a-CAGCCTGAGCTATCGATGCCCCTGCCG-3. (forward) i 5. -GGGCATCGATAGCTCAGGCTGACTGGTCTACCGTC-3. (rewers). Te dwa produkty PCR wklonowano do retrowirusowego wektora pLZRS-IRES-hyg-EGFP. Komórki TAM2D2 transfekowano i sortowano pojedynczo komórkowe FACS w celu wybrania klonów o wysokiej ekspresji EGFP. Konstrukt TARC-KDEL wytworzono przez PCR ze starterami 5a-TAGCGAATTCACCATGAGGTCACTTCAGA-3. (forward) i 5. -TAGCTACGTATTACAGCTCGTCCTTCTCGCTCGGCCTTGGGTTTTTCAC-3. (wstecz z tagiem KDEL). Konstrukt sklonowano w retrowirusowym wektorze pLZRS-IRES-puro-EGFP. Wektor ten był oparty na wektorze pLZRS-IRES-zeo (29), w którym cDNA oporności na zeocynę zastąpiono cDNA kodującym wzmocnione przez oporność na puromycynę. Białko fuzyjne EGFP (30).
[podobne: bmi kalkulator dla dzieci, choroba hashimoto a ciąża, jak sobie poradzić po rozstaniu ]
[patrz też: definicja sukcesu, brian tracy opinie, zostań rentierem opinie ]