Skip to content

Retencja CXCR4 w retikulum endoplazmatycznym blokuje rozprzestrzenianie się hybrydomy komórek T. ad 5

2 miesiące ago

772 words

Komórki wyizolowane z dużego guza badano na ekspresję EGFP. Ekspresja EGFP została prawie całkowicie utracona, dlatego też prawdopodobnie zniknęło również ekspresja SDF-1-KDEL, więc jest to prawdopodobnie powód, dla którego nastąpiło rozpowszechnienie. Aby ustalić, że wszystkie linie komórkowe były zdolne do wzrostu in vivo, 106 komórek wstrzyknięto podskórnie, a wielkość guza śledzono w czasie. Wielkość wszystkich nowotworów wzrastała 2,4 razy dziennie, co pokazuje, że zmniejszonej zdolności przerzutowej transfektantów SDF-1-KDEL nie można przypisać odrzuceniu lub zaburzeniu wzrostu in vivo. Figura 4Działanie klonów SDF-1-KDEL. Pokazano krzywe przeżycia nagich myszy, którym wstrzyknięto dożylnie 5 x 105 komórek. Myszy zabijano, gdy były konające lub po 100 dniach. Pięciu myszom wstrzyknięto puste transfektanty wektorowe, a dziesięć i dziewięć myszy wstrzyknięto odpowiednio transfektantom SDF-K7 i SDF-K17. Nieuzasadniony mutant. Zatrzymanie chemokiny w ER może mieć niepożądane skutki. Chociaż jest to mało prawdopodobne, można sobie wyobrazić, że wiązanie białka SDF-1-KDEL z CXCR4 w ER indukuje sygnały, które mogłyby, na przykład, doprowadzić do obniżenia poziomu podstawowych szlaków. Aby wykluczyć tę możliwość, wprowadziliśmy mutację w konstrukcie SDF-1-KDEL w celu zmiany pierwszego aminokwasu dojrzałego peptydu z lizyny na argininę (Figura 5a). Ta mutacja zmienia chemokinę z agonisty w niejonistycznego antagonistę (33). Klony o wysokiej ekspresji SDF (K1R) -KDEL wybrano w sposób podobny do ekspresji niezmutowanego SDF-1-KDEL. Hybrydoma komórek T transfekowano tym zmutowanym SDF (K1R) -KDEL, a transfektanty sortowano FACS z pojedynczej komórki w celu wybrania klonów o wysokiej ekspresji EGFP (Figura 5b i dane nie pokazane). Otrzymano cztery klony o porównywalnej ekspresji. Było to jednak tylko 50% poziomu niezmutowanych transfektantów SDF-1-KDEL opisanych powyżej (Figura 1b). W rezultacie CXCR4 może nie zostać całkowicie zatrzymany w ER, tak że niskie poziomy receptora mogą nadal być obecne na powierzchni komórek. Rzeczywiście, jak pokazano na Figurze 5c, klony SDF (K1R) -K10 i K30 nadal były zdolne do wiązania 125I-SDF-1, około jednej trzeciej ilości związanej przez komórki TAM2D2 i puste transfektanty wektorowe. Jak pokazano na Figurze 6a, chemotaksja dwóch klonów SDF (K1R) -KDEL w kierunku SDF-1 również została zmniejszona, ale nie całkowicie zablokowana. Wyniki uzyskane dla innych klonów były podobne (dane niepokazane). W teście inwazji redukcja była dość znaczna, ale znowu inwazja nie była całkowicie zablokowana (Figura 6b i dane nie pokazane). Figura 5 Redukcja poziomów powierzchni CXCR4 przez niesygnałowy mutant SDF-1-KDEL, SDF (K1R) -K. (a) Schematyczne przedstawienie wektorów ekspresyjnych. Pierwszy aminokwas dojrzałego białka SDF-1 (K) zmutowano do argininy (R) w celu otrzymania niesygnalizującego SDF-1 i połączono z sekwencją KDEL. CDNA ulegało ekspresji przy użyciu wektora retrowirusowego pLZRS-IRES-Hyg-EGFP. (b) Analiza FACS ekspresji EGFP klonów SDF (K1R) -KDEL. Wypełnione histogramy to poziomy EGFP, otwarte histogramy pochodzą od nietransfekowanej kontroli. Pokazane są dwa reprezentatywne klony na pięć. (c) Wiązanie 125I-SDF do zmutowanych klonów SDF (K1R) -KDEL w porównaniu z komórkami TAM2D2 i pustymi wektorami transfektantów. Pokazano jeden reprezentatywny eksperyment na trzy. Rysunek 6 Migracja, inwazja i rozpowszechnianie klonów SDF (K1R) -KDEL. Pokazane są wyniki dwóch z pięciu klonów, SDF (K1R) -K10 i SDF (K1R) -K30. (a) Dane to procent komórek, które migrowały w ciągu 2 godzin przez filtr do dolnej komory transfuzji zawierającej różne stężenia SDF-1 i są to średnie z pięciu przeprowadzonych eksperymentów. (b) Dane są wartościami procentowymi komórek, które zaatakowały w monowarstwę REF po godzinie i są średnie. SEM z sześciu przeprowadzonych eksperymentów. (c) Pokazano przeżycie syngenicznych myszy AKR, którym wstrzyknięto dożylnie 5 x 105 komórek. Zwierzęta były zabijane, gdy były konające lub po 100 dniach. Dwa klony SDF (K1R) -K10 i SDF (K1R) -K30 wstrzyknięto do żył ogonowych odpowiednio ośmiu i pięciu syngenicznych myszy AKR. Krzywa przeżycia została przedstawiona na rysunku 6c. Wszystkie pięć myszy, którym wstrzyknięto transfektant SDF (K1R) -K30 przeżyło. Po 100 dniach myszy badano makroskopowo i mikroskopowo i nie stwierdzono żadnych nieprawidłowości. Siedem z ośmiu myszy, którym wstrzyknięto klon SDF (K1R) -K10, zmarło w ciągu 100 dni, ale znacznie później niż myszy, którym wstrzyknięto komórki kontrolne. Dwie z tych myszy miały przerzuty w tylnej nodze, które były obserwowane od czasu do czasu w poprzednich eksperymentach z normalnymi komórkami TAM2D2
[podobne: zapalenie migdałków leczenie, bmi kalkulator dla dzieci, laserowe usuwanie zylakow ]
[podobne: bmi kalkulator dla dzieci, aparat ortodontyczny na raty, urolog dziecięcy rzeszów ]