Skip to content

Rekrutacja komórek NK za pośrednictwem chemokin jest kluczowym mechanizmem obronnym gospodarza w inwazyjnej aspergilozie cd

1 tydzień ago

738 words

W przypadku różnych testów, naczynia krwionośne płuc perfundowano za pomocą ml PBS zawierającego 5 mM EDTA przez prawą komorę, wycięto, zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze. 20 ° C aż do dnia testu. W dniu testu próbki homogenizowano w kompletnym buforze koktajlowym inhibitora proteazy (Roche Applied Science, Indianapolis, Indiana, USA) w PBS, poddanego działaniu ultradźwięków i otrzymanej zawiesinie stosowanej do oznaczania aktywności mieloperoksydazy (MPO) lub zawartości chityny. W przypadku ELISA zawiesinę osadzono w peletkach i supernatanty przepuszczono przez filtry 0,45 .m (Gelman Sciences Inc., Ann Arbor, Michigan, USA) i przechowywano w temperaturze 4 ° C przez 3 dni, aż do przeprowadzenia testu ELISA przy użyciu MCP. -1 / CCL2a specyficzny zestaw według instrukcji producenta (R & D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA, minimalne wykrywalne stężenie mniejsze niż 2 pg / ml). Aktywność płuc MPO. Aktywność MPO narządu mierzono jako marker sekwestracji neutrofili, jak opisano wcześniej (28). Pokrótce, 100 .l porcji każdego homogenatu płuc dodano do 100 .l buforu zawierającego 50 mM fosforanu potasu (pH 6,0), 5% bromku heksadecylotrimetyloamoniowego i 5 mM EDTA. Próbki sonikowano przez 10 sekund i odwirowano przy 3000 g przez 15 minut. Supernatant zmieszano w stosunku 1:15 z buforem zawierającym M monozasadowy fosforan potasu, M dwuzasadowy fosforan potasu, 3% H2O2 i chlorowodorek o-dianizydyny i odczytano przy 490 nm. Aktywność MPO obliczono jako zmianę chłonności w czasie. Test chityny w płucach. Pleśnie, takie jak gatunki Aspergillus, rosną jako wielokomórkowe rozgałęzione struktury włókienkowe (strzępki) i nie tworzą niezawodnie struktur reprodukcyjnych (konidiów) w zainfekowanych tkankach (29). W rezultacie seryjne rozcieńczenie i hodowla zhomogenizowanej tkanki nie jest odpowiednią miarą obciążenia patogenem w tych zakażeniach. W związku z tym wykorzystaliśmy wcześniej opisany test na chitynę w celu ilościowego określenia obciążenia patogenem w płucach (19). Chityna, składnik ściany strzępkowej, nie występuje w konidiach i tkankach kręgowców. Poziom chityny, jak wykryto w tym teście, koreluje bezpośrednio z ciężarem strzępków (30). Płuca homogenizowano, odwirowywano i ponownie zawieszano w laurylosiarczanie sodu (3% wag./obj.), Ogrzewano w temperaturze 100 ° C przez 15 minut, przemyto i ponownie zawieszono w KOH (120% wag./obj.). Następnie ogrzewano w temperaturze 130 ° C przez 60 minut, schłodzono, inkubowano na lodzie po dodaniu 8 ml lodowatego 75% etanolu, osadzono po dodaniu 0,3 ml celitu (ziemia okrzemkowa), zawieszono i ponownie zawieszono w 0,5 ml wody destylowanej. Do każdej próbki dodaliśmy 0,5 ml NaNO2 (5% wag./obj.) I KHSO4 (5% wag./obj.) Oraz wzorce zawierające wodę destylowaną i 10 .g / ml glukozaminy. Porcje (0,6 ml) każdego z nich przeniesiono do oddzielnych probówek, dodano 0,2 ml sulfaminianu amonu i 0,2 ml monohydratu HCl hydrazonu 3-metylo-2-tiazolonu (50 mg w 10 ml wody destylowanej) i próbki ogrzano do 100 ° C. C przez 3 minuty, a następnie ochłodzono. Następnie do każdej próbki dodano FeCl3 . 6H2O (0,2 ml, 0,83% wag./obj.) I zmierzono OD przy 650 nm po 25 minutach. Następnie obliczono zawartość chityny w ekwiwalentach glukozaminy: zawartość chityny = [5 x (OD narządu na OD organu kontrolnego)]: (gęstość optyczna glukozaminy – OD wody). Zawiesina jednokomórkowa płuc. Zawiesiny pojedynczych komórek w płucach przygotowano zgodnie z wcześniejszym opisem (31). W skrócie, perfundowane płuca zostały wycięte, zmielone do drobnej zawiesiny i inkubowane w kolagenazy typu A mg / ml (Roche Applied Science) i 30 U / ml DNazy (Sigma-Aldrich) w RPMI (Sigma-Aldrich) w 37 ° C przez 30 minut. Komórki następnie mechanicznie zdyspergowano przez odessanie i wyrzucenie zawiesiny w strzykawkach (Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, New Jersey, USA), przepuszczono przez filtry siatkowe Nitex (Tetko Inc., Kansas City, Missouri, USA), a następnie przeszły przez gradient 40% Percoll (Sigma-Aldrich) przed zliczeniem komórek pod hemacytometrem. Cytometrii przepływowej. W celu identyfikacji różnych populacji leukocytów, 106 komórek z zawiesin płuc lub śledziony, przygotowanych jak opisano powyżej, barwiono przez 15 minut na lodzie za pomocą następujących Ab: anty-CD3-allofikocyjanina (anty-CD3-APC), anty-CD8. -phycoerythrin (anty-CD8-PE), anty-CD11b-APC, białko anty-CD45-perydynina chlorofilowe A (anty-CD45-PerCP), anty-DX5-PE lub -FITC, anty-F4 / 80-PE, przeciw . Ly6G-FITC i anty-NK1.1-biotyna lub -PE (wszystkie z PharMingen, San Diego, Kalifornia, USA). Następnie próbki płukano w buforze do barwienia, utrwalano w 1% paraformaldehydzie (Sigma-Aldrich) w PBS i utrzymywano w ciemności w temperaturze 4 ° C aż do analizy na cytometrze FACScalibur przy użyciu oprogramowania Cellquest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, California, USA)
[podobne: ćwiczenia z hantlami na klate, aparat ortodontyczny na raty, brian tracy opinie ]
[patrz też: zostań rentierem opinie, sukces definicja, marek kamiński blog ]