Skip to content

Potencjalna rola aktywowanego NF-kB w patogenezie zespołu eutyreozy czesc 4

2 miesiące ago

194 words

Dane wyrażono jako średnią plus lub minus SD. Różnice statystyczne analizowano za pomocą jednoczynnikowej ANOVA z testem Bonferroniego we wszystkich doświadczeniach. Wyniki Hamowanie zależnego od T3 wzrostu mRNA 5 (3 -DI i aktywności enzymatycznej TNF-a. Aby sprawdzić, czy TNF-a może być zaangażowany w hamowanie ekspresji genu 5 (3-Dl w wątrobie, analizę Northern blot przeprowadzono z użyciem komórek HepG2. Jak podano wcześniej (1), inkubacja komórek HepG2 z T3 przez 24 godziny spowodowała wzrost poziomów mRNA 5 (3-Dl (Figura 1). Wzrost mRNA zależny od T3 był 3,3-krotny. W obecności TNF-a, poziomy 5. -D1 mRNA bez T3 nie były zmieniane. Jednakże indukcja mRNA 5 (3-Dl przez T3 była osłabiona przez TNF-a. do 1,2-krotnie, co sugeruje, że TNF-a upośledza zależną od T3 indukcję ekspresji mRNA 5 (3-Dl. Rysunek 1TNF-. osłabia zależną od T3 indukcję genu 5A-D1 typu I. (a) Komórki HepG2 traktowano T3 (100 nM) i / lub TNF-a. (100 U / ml) przez 24 godziny. Poziomy mRNA 5 (3-Dl i GAPDH określono przez analizę Northern blot. (b) Radioaktywność zhybrydyzowanych pasm zmierzono za pomocą Fujix Bioimage Analyzer BAS 2000. Poziomy mRNA 5 (3 -DI / GAPDH (w arbitralnych jednostkach) wyrażono jako średnie. SD. (c) Przedstawiono fałdowanie mRNA 5 (3-Dl / GAPDH przez T3. AP <0,0001 vs. T3 (.); BP <0,0001, T3 (+), TNF-a (a) vs. T3 (+), TNF-a (+) w b; CP <0,0001 vs. TNF-a (.) w c. Następnie zbadaliśmy, czy zmiany poziomów mRNA 5 (3-D1 są związane z 5 (3-Dl. Jak pokazano na Figurze 2, aktywność enzymu zwiększono 2,3-krotnie (z 21,8. 4,0 do 51,3. 6,1 pmol uwolnionego I. / Mg / min) w obecności T3. TNF-. leczenie nie zmieniło aktywności bez T3, ale upośledzone zależne od T3 zwiększenie aktywności tego enzymu. W ten sposób wykazano, że hamowanie zależnego od T3 wzrostu mRNA 5 (3-Dl przez TNF-a. było związane ze zgodną zmianą aktywności enzymu. Rysunek 2TNF-. zmniejsza zależny od T3 wzrost aktywności enzymu 5 (3-Dl. (a) Komórki HepG2 traktowano T3 (100 nM) i / lub TNF-a. (100 U / ml) przez 24 godziny. Aktywność enzymatyczną 5 (3-Dl w ekstrakcie cytosolowym wyrażono jako średnią. SD (n = 6). (b) Przedstawiono krotność indukcji aktywności enzymu 5 (3-Dl przez T3. AP <0,0001 vs. T3 (.); BP <0,0001, T3 (+), TNF-a (a) vs. T3 (+), TNF-a (+) w a; CP <0,0001 vs. TNF-a (.) w b. Hamowanie zależnej od T3 indukcji 5 (3-DI przez aktywowany NF-kB. Ponieważ TNF-a indukuje translokację jądrową i wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego NF-kB, aktywowany NF-kB w komórkach HepG2 analizowano za pomocą EMSA przy użyciu oligonukleotydu wiążącego NF-kBs jako sondy. Ekstrakt jądrowy komórek HepG2 hodowanych w nieobecności TNF-a wykazywały dwa słabe kompleksy białko-DNA, a ilości tych kompleksów zwiększono po 1-godzinnym traktowaniu TNF-a. (Figura 3a). Wiązanie sondy zostało całkowicie przesunięte przez nieznakowany oligonukleotyd wiążący NF-kBy, ale nie przez zmutowany oligonukleotyd. Analiza Supershift przy użyciu przeciwciał swoistych dla podjednostki do różnych składników NF-kB wykazała, że kompleksy te zawierały p65 i p50 (Figura 3b). Inne przeciwciała rozpoznające p52, c-Rel, RelB lub Bcl-3 nie wpływały na ruchliwość kompleksów wiążących. Sugeruje się zatem, że działanie TNF-a może być mediowany przez heterodimer p65 p50 w komórkach HepG2. Figura 3 Charakterystyka aktywowanego NF-kB w komórkach HepG2. (a) Aktywacja NF-kB przez TNF-a w komórkach HepG2 badano stosując EMSA. Ekstrakt jądrowy wytworzono po 1-godzinnym traktowaniu TNF-a. (b) Charakteryzacja kompleksu NF-kB za pomocą analizy supershift. Przeciwciała specyficzne dla podjednostek NF-kB zastosowano w EMSA. mut, zmutowany; oligo, oligonukleotyd. Następnie badaliśmy, czy aktywowana NF-kB wpływa na zależną od T3 indukcję genu 5 (3-D1. W tym celu zastosowaliśmy przejściową analizę transfekcji w komórkach HepG2 przy użyciu genów reporterowych lucyferazy kierowanych przez promotor genu 5 (3-D1 (5 (3 -DI Luc). Jak pokazano na Figurze 4, T3 nieznacznie zwiększyła aktywność 5 (3-D1-Luc przy braku transfekowanego TR, chociaż wzrost nie był statystycznie istotny. Gdy komórki transfekowano plazmidem eksprymującym TR, T3 indukował ekspresję 5 (3-D1 Luc około 3,3-krotnie (Figura 4b). Dodatek TNF-a nie zmienia aktywności Luc w przypadku braku T3, z lub bez kotransfekowanego TR. Jednak TNF-a zmniejszoną zależną od T3 aktywację 5 (3 -DI Luc do 2,3-krotnego w komórkach również transfekowanych plazmidem wyrażającym TR. Wyniki te są zgodne z tymi uzyskanymi z analizy Northern blot i testu enzymatycznego 5 (3-Dl (Fig. i 2). Wpływ TNF-a był uważany za spowodowany aktywacją NF-a, ponieważ kotransfekcja dominującej negatywnej p65 zapobiega skutkom TNF-a indukowana przez T3 ekspresja 5 -DI reportera genu (TR + TNF-a + p65DN) [więcej w: choroba hashimoto a ciąża, olejek arganowy gdzie kupić, zostań rentierem opinie ] [patrz też: bmi kalkulator dla dzieci, aparat ortodontyczny na raty, urolog dziecięcy rzeszów ]