Skip to content

Potencjalna rola aktywowanego NF-kB w patogenezie zespołu eutyreozy cd

1 miesiąc ago

705 words

Dane wyrażono jako średnią plus lub minus SD (n = 6). Obróbka komórek i przygotowanie ekstraktu jądrowego. Komórki HepG2 utrzymywano w DMEM zawierającym 5% odpędzonego węglem FBS przez co najmniej 16 godzin. Po godzinie preinkubacji z CAM, TNF-a dodano i komórki inkubowano przez kolejną godzinę. Komórki następnie zebrano i poddano przygotowaniu ekstraktu jądrowego. Sposób przygotowania ekstraktu opisano wcześniej (33). Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej. Metodę testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i sekwencji użytych oligonukleotydów (oligonukleotydy NF-kB i TRE-Lap) opisano uprzednio (26, 34). W przypadku analiz supershift, antysurowice przeciwko każdej podjednostce NF-kB (przeciwciała anty-p50, p52, p65, c-Rel, RelB i Bcl-3, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia, USA) dodano po tworzenie kompleksu białko-DNA i dalej inkubowano na lodzie przez godzinę. Mieszaniny reakcyjne naniesiono w 5% żelu poliakrylamidowym z 2,5% gliceryną i 0,5 x TBE (45 mM Tris-boran, mM EDTA). Translowane in vitro TR3, RXRa lub p65 z NF-kB zsyntetyzowano za pomocą sprzężonego z TNT układu lizatu retikulocytów (Promega), zgodnie z protokołem od dostawcy. Testy przejściowej ekspresji. Ludzkie komórki JEG-3 linii komórkowej naczyniówkowego raka wątroby hodowano w Opti-MEM (Life Technologies, Grand Island, Nowy Jork, USA) zawierającym 2% FBS, penicylinę i streptomycynę. Komórki HepG2 hodowano w DMEM zawierającym 10% FBS. Komórki wysiewano na 12-studzienkowe płytki na 16 godzin przed transfekcją i transfekowano je metodą z fosforanem wapnia (35). Plazmid reporterowy (1 .g) transfekowano razem z plazmidem wyrażającym TR (100 ng), albo plazmidem eksprymującym p50, p65 lub p65 DN. Całkowitą ilość plazmidu utrzymywano na stałym poziomie w każdej transfekcji przez dodanie plazmidu kontrolnego bez wstawki cDNA. W celu monitorowania wydajności transfekcji zastosowano plazmid ekspresji p-galaktozydazy (pEBV y-gal: 50 ng na studzienkę). Po 4 godzinach. ekspozycja na osad fosforanu wapnia-DNA, pożywka hodowlana zawierająca FBS z odpędzonym węglem drzewnym została dodana, z lub bez 100 nM T3. Zastosowano DMEM z 5% odpędzonymi FBS dla komórek HepG2 i Opti-MEM z 2% odpędzonymi FBS dla komórek JEG-3. Komórki zebrano po 24 godzinach i zmierzono aktywność lucyferazy (36) przy użyciu luminometru (LB9501, Berthold, Wildbad, Niemcy). Aktywność (3-galaktozydazy badano przy użyciu zestawu do analizy (3-galaktozydazy (Galacto-Light Plus, Tropix, Bedford, Massachusetts, USA). Aktywność lucyferazy była korygowana przez aktywność p-galaktozydazy. Transfekcje przeprowadzono trzykrotnie i powtarzano co najmniej trzy razy. Dane wyrażano jako aktywność lucyferazy / P-galaktozydazy (jednostka arbitralna), lub fałdowanie indukcji przez T3 (przy użyciu dodatnich konstruktów reporterowych TRE) lub procentową względną aktywność lucyferazy przez T3 (TSH-akat). Drożdżowy system dwuhybrydowy. Interakcję pomiędzy TR i p65 analizowano za pomocą drożdżowego systemu dwuhybrydowego (Matchmaker Two-Hybrid System; Clontech, Palo Alto, California, USA), zgodnie z protokołem od dostawcy. Plazmid pGBT9 transformowano plazmidem pACT2 do komórek drożdży (Y187). Trp +, kolonie Leu + hodowano w pożywce SD bez tryptofanu i leucyny, a aktywność p-galaktozydazy w płynnej hodowli określano przy użyciu zestawu do testu (3-galaktozydazy. Obliczono aktywność .-galaktozydazy / gęstość komórek (OD600) w celu oceny połączenia dwóch białek. System dwóch hybryd ssaków. Interakcję pomiędzy TR i p65 analizowano również za pomocą dwuhybrydowego systemu ssaczego (zestaw dwóch hybryd testowych Mammalian Matchmaker, Clontech) zgodnie z protokołem od dostawcy. Gal4 DBD-TR (pM-TR) i VP16-p65 (pVP-p65) transfekowano do komórek JEG-3 metodą fosforanu wapnia, razem z genem reporterowym lucyferazy reagującym na GAL (pG Luc). Dwadzieścia cztery godziny po transfekcji mierzono aktywność lucyferazy, aby ocenić związek pomiędzy TR i p65. Chemikalia. Ludzki rekombinowany TNF-a (2,5 x 103 U /. G) został dostarczony przez Asahi Chemical Industry (Tokio, Japonia). CAM został dostarczony przez Taisho Pharmaceutical (Tokio, Japonia) i rozpuszczony w DMSO do końcowego stężenia 10. M jako roztworu podstawowego. Dodano DMSO w celu dostosowania stężenia w doświadczeniach za pomocą CAM. Maksymalne stężenie zastosowanego CAM wynosiło 10-4 M, w oparciu o następującą obserwację: zwykle stosowana dawka CAM wynosi 200 400 400 mg / dobę u dorosłych, a stężenie we krwi obwodowej wynosi około 1,0 .g / ml (1,34 × 10 6 M) (37). W doświadczeniach na szczurach i myszach stwierdzono, że stężenia CAM w wątrobie, płucach i nerkach są 24-84 razy większe niż w krwi obwodowej (38). Analizy statystyczne
[hasła pokrewne: laserowe usuwanie zylakow, olej kokosowy na włosy jak stosować, rentierstwo ]
[przypisy: bestia z wolfsberga cda, techniki relaksacyjne dla dzieci, zioła na odchudzanie ojca klimuszko ]