Skip to content

Mysi model autosomalnej dominującej moczówki prostej neurohypophyseal ujawnia postępującą utratę neuronów produkujących wazopresynę czesc 4

6 dni ago

757 words

Liczbę komórek wyrażono jako stosunek liczby neuronów NPII-dodatnich do liczby neuronów OT-dodatnich. W celu określenia kosztów NPII za pomocą BiP (Grp78) lub Chop (Gadd153), szkiełka były blokowane za pomocą normalnej surowicy osła i koinkubowane z kozim anty-NPII i króliczym anty-Gadd153 (F-168, 1:20; Santa Cruz Biotechnology Inc.) lub królicze anty-Grp78 (H-129, 1:20; Santa Cruz Biotechnology Inc.) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po płukaniu, szkiełka inkubowano z skoniugowanymi z Cy3 osiołami anty-kozimi IgG i skoniugowanymi z FITC osiołami przeciw-króliczymi IgG (obie 1: 100; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pensylwania, USA) przez godzinę w temperaturze pokojowej. W celu wykrycia kaspazy-3, szkiełka były blokowane za pomocą normalnej surowicy koziej i inkubowane z króliczą anty-ciętą kaspazą-3 (9661S, 1: 100; Westburg BV, Leusden, Holandia) przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po płukaniu, szkiełka inkubowano z biotynylowaną anty-króliczą IgG. Wykryto RTU Peroksydazę chrzanową streptawidynę i DAB jak powyżej. W celu wykrycia katepsyny D, szkiełka blokowano normalną surowicą osła i inkubowano z kozią anty-katepsyną D (sc-6489, 1: 100, Santa Cruz Biotechnology Inc.) przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po płukaniu, szkiełka inkubowano ze skoniugowanymi z Cy3 osiołami anty-kozimi IgG. Wyniki Generowanie myszy Avp KI. Myszy niosące mutacje w genie Avp wytworzono przez rekombinację homologiczną, stosując standardowe techniki i konstrukty kierujące zilustrowane na Figurze 1a. Chimeryczne samce były hodowane na samice WT 129SvJ, a transmisję zarodkową wykryto przez PCR i trawienie restrykcyjne (dane nie przedstawione). Zwierzęta heterozygotyczne pod względem mutacji i zawierające kasety neomycynowe oflankowane przez miejsca loxP zostały wyhodowane na transgenicznych zwierzętach 129SvJ eksprymujących rekombinazę Cre pod kontrolą promotora cytomegalowirusa (42), a wycięcie kasety neomycyny potwierdzono za pomocą PCR z użyciem starterów flankujących ten pozostały strona loxP (dane nie pokazane). Dla jednej z dwóch linii założycielskich dla każdej mutacji, prawidłowe celowanie zostało potwierdzone przez analizę Southern blot (Figura 1b). W przypadku mutacji A (a 1) T zmutowany allel wprowadził nowe miejsce ScaI i wycięcie kasety neomycynowej wprowadziło nowe miejsce XbaI, w wyniku czego powstały fragmenty restrykcyjne Xbal i ScaI o długości 1507 i 404 pz, w porównaniu z 2375 pz dla normalnego allel. Zmutowany allel C67X wprowadził nowe miejsce NheI, w wyniku czego otrzymano fragmenty restrykcyjne EcoRI i NheI z 978 i 3600 pz DNA, podczas gdy normalny allel wytworzył fragment o długości 4,578 pz. Późniejsza hodowla dała zwierzęta zawierające mutacje, ale pozbawione rekombinazy Cre. Te zwierzęta i ich kontrolne ściółki były stosowane we wszystkich kolejnych badaniach. Ekspresja zmutowanych genów Avp w podwzgórzu myszy. Przeprowadzono RT-PCR w celu oceny ekspresji transkryptów Avp z normalnych i zmutowanych alleli w podwzgórzu myszy (Figura 1c). RT-PCR dało produkty amplifikacji 366 i 267 bp dla linii A (a1) T i C67X, odpowiednio. Zmutowane allele A (a 1) T i C67X normalne i zmutowane można było rozróżnić w heterozygotach, trawiąc produkty amplifikacji odpowiednio ScaI i NheI. Trawienie ScaI produktów PCR z myszy AvpA (a 1) T / + wytworzyło pasmo 366 bp z normalnego allelu i prążków 265 i 101 bp ze zmutowanego allelu. Trawienie Nhe produktów PCR u myszy AvpC67X / + dawało pasmo WT 267 bp i fragmenty 163-bp i 104-bp ze zmutowanego allelu. Normalne i zmutowane allele były wyrażane na podobnych poziomach w obu liniach myszy. Myszy AvpC67X / C67X umierają wkrótce po urodzeniu, podczas gdy myszy AvpA (a 1) T / A (a 1) są żywe. Zmutowane myszy hodowano do homozygotyczności stosując standardowe krzywe heterozygoty. W przypadku mutacji A (a 1) T uzyskano potomstwo o oczekiwanym stosunku genotypów mendelowych. W przeciwieństwie do tego, krzyżówki myszy AvpC67X / + nie wytwarzały homozygot w okresie odstawienia od piersi (tj. 3 tygodnie) z 12 miotów. Jako że zaobserwowano nienormalną liczbę martwych 2- do 4-dniowych młodych w klatkach z żywym potomstwem z krzyżówek heterozygoty C67X, genotypowano 1-dniowe szczenięta z 11 dodatkowych krzyżówek AvpC67X / +. Mioty te zawierały 17 WT, 33 heterozygoty i 15 szczeniąt homozygotycznych, co pokazuje, że homozygoty C67X rodzą się z oczekiwaną częstością, ale umierają wkrótce po urodzeniu, prawdopodobnie z odwodnienia. Dane te zestawiono w Tabeli i Tabeli 2. Tabela Bezobszarowe i względne liczby myszy z allelem A (a 1) Tabela 2 Bezobszarowe i względne liczby myszy z myszami z awotypem C67X AvpC67X / +, ale nie z AvpA (A 1) Myszy T / + lub AvpA (A 1) T / A (A 1) T, wyświetlają zmieniony pobór wody, wydalanie moczu i osmolalność moczu
[hasła pokrewne: jak sobie poradzić po rozstaniu, urolog dziecięcy rzeszów, novision ]
[hasła pokrewne: marek kamiński blog, poradnia osteoporozy warszawa, bestia z wolfsberga cda ]