Skip to content

Mysi model autosomalnej dominującej moczówki prostej neurohypophyseal ujawnia postępującą utratę neuronów produkujących wazopresynę cd

2 miesiące ago

683 words

Po sieciowaniu UV błonę zablokowano i hybrydyzowano z znakowanymi 32P sondami w buforze Rapid-hybrid (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Anglia) zgodnie z instrukcjami producenta. Bloty następnie przemyto trzy razy i wystawiono na błonę. Przygotowanie RNA i RT-PCR. Mózgi myszy zostały rozcięte i szybko zamrożone. Całkowity RNA ekstrahowano z bloku tkankowego zawierającego podwzgórze stosując odczynnik TRIzol (Invitrogen Corp.) według protokołu producenta. Wyekstrahowane RNA traktowano DNase I (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA), odwrotnie transkrybowano z zastosowaniem odwrotnej transkryptazy AMV (Promega Corp.) i przyłączono do losowych starterów heksamerowych. Produkt reakcji RT poddano amplifikacji PCR za pomocą polimerazy Taq (Promega Corp.) w obecności śladowej ilości dCTP znakowanego 32P, stosując następujący protokół: 94 ° C przez 4 minuty; 37 cykli minuty w 94 ° C, minuta w 55 ° C i 1,5 minuty w 72 ° C; i 10 minut w 72 ° C. Startery stosowane do generowania fragmentu DNA obejmującego miejsce mutacji były następujące: 5 (3 -ACAGTGCCCACCTATGCTCGCCAGGATGCT-3. i 5. -CGTCGCTGCAGCAGATGCCACGGCGG-3. dla mutacji A (a 1) T i 5a-TGGCGTTGCTTGGCTCCCGAGCGCGGGTGA-3. i 5. -GCGGCCCGGGCGGCAAAGGACGCTGCTTCG-3. dla mutacji C67X. Po elektroforezie na 2% żelu agarozowym, produkty PCR wycięto z żelu i DNA wyekstrahowano za pomocą zestawu do ekstrakcji żeli z Qiagen Inc. (Valencia, Kalifornia, USA). Oczyszczony DNA strawiono ScaI dla mutacji A (a1) T lub NheI dla mutacji C67X. Strawiony i niestrawiony DNA następnie przepuszczono przez 8% żel poliakryloamidowy. Po wysuszeniu żel wystawiono na płytkę do obrazowania BAS-III (Fuji Photo Film Co., Tokio, Japonia) i analizowano za pomocą oprogramowania Storm 860 PhosphorImager i ImageQuant (Amersham Biosciences). Badania metaboliczne. Klatki metaboliczne (Nalge Nunc International, Rochester, New York, USA) były używane do zbierania moczu od myszy. Mocz pobrano przez 24 godziny po okresie habituacji trwającym co najmniej 24 godziny. Pobór wody mierzono ważąc butelki przed i po tym okresie. Objętość moczu oznaczano grawimetrycznie, po czym przechowywano w temperaturze ~ 20 ° C. Moczowość osmolalności zmierzono za pomocą mikromomometru (model 3300, Advanced Instruments Inc., Norwood, Massachusetts, USA). Test AVP w surowicy. Pobrano krew z trzonu i izolowano surowicę przez odwirowanie przez 15 minut przy 11 750 g w 4 ° C. AVP ekstrahowano z surowicy przy użyciu C18 Amprep Minicolumns (Amersham Biosciences) i testowano za pomocą ELISA zgodnie z instrukcjami producenta (Assay Designs Inc., Ann Arbor, Michigan, USA). Dane zebrano i analizowano za pomocą oprogramowania Emax Microplate Reader i Softmax Pro 2.1 (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, California, USA). Immunohistochemia. Mózgi utrwalono przez 24 godziny w 10% obojętnej buforowanej formalinie w temperaturze 4 ° C. Osadzanie i cięcie w parafinie (do 5. M grubości) zostało wykonane przez Patologię Core Facility w Northwestern Memorial Hospital (Chicago, Illinois, USA). Skrawki poddano deparafinizacji i uwodniono za pomocą ksylenów i stopniowanych serii alkoholi, a następnie przemyto i permeabilizowano TBS / 0,025% Tween-20 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). W celu wyodrębniania NPII i oksytocyny aktywność endogennej peroksydazy blokowano przez inkubację szkiełek w 3% nadtlenku wodoru / metanolu. Skrawki blokowano 5% normalną surowicą końską (Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, USA) i inkubowano z kozim przeciwciałem poliklonalnym przeciwko mysiej NPII (1 (jg / ml, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornia, USA ) przez godzinę. Skrawki następnie inkubowano z biotynylowaną końską IgG przeciw IgG (6 .g / ml, Vector Laboratories Inc.) i skoniugowaną ze streptawidyną alkaliczną (streptawidyna 1: 500, Vector Laboratories Inc.) przez 10 minut każda, a następnie barwienie z użyciem Zestaw III substratu fosfatazy alkalicznej (Vector Laboratories Inc.). Po przemyciu TBS / 0,025% Tween-20 i zablokowaniu 5% normalnej surowicy koziej, skrawki inkubowano z króliczym poliklonalnym przeciwciałem anty-OT (przeciw oksytocynie) (Oncogene Research Products, San Diego, Kalifornia) przez godzinę iz kozie anty-królicze IgG (6 ug / ml) i peroksydazę chrzanową (RTU) z peroksydazą RTU (oba z firmy Vector Laboratories Inc.) przez 10 minut każdy. Skrawki wybarwiono układem Substrate-Chromogen DAB (DAKO Corp., Carpinteria, California, USA). Neurony, które zostały zabarwione w jądrze przykomorowym (PVN) natychmiast po grzbietowej stronie jądra suprachiasmatycznego, zostały zliczone przez ślepego obserwatora przy użyciu mikroskopu świetlnego przy powiększeniu x 200. Uwzględniono tylko te neurony, które mają wyraźnie określone komórki i jądro komórkowe
[przypisy: techniki relaksacyjne dla dzieci, jak sobie poradzić po rozstaniu, piłka do siedzenia przy biurku ]
[przypisy: brian tracy opinie, zostań rentierem opinie, sukces definicja ]