Skip to content

Mysi model autosomalnej dominującej moczówki prostej neurohypophyseal ujawnia postępującą utratę neuronów produkujących wazopresynę ad

4 tygodnie ago

748 words

Opracowano dwa modele KI, z których każdy zawierał inną mutację punktową opisaną u ludzi. Pierwszą mutacją jest mutacja peptydu sygnału A (A!) T, która powoduje nieskuteczne cięcie peptydu sygnałowego przez peptydazę sygnałową (10) i względnie łagodny fenotyp u ludzi (35). Inną mutacją jest mutacja nonsensowna C67X, która wytwarza prekursor AVP obcięty w domenie NPII (15). Ekspresja tej bezsensownej mutacji w hodowanych komórkach powodowała niższą żywotność niż w przypadku komórek eksprymujących inne rodzaje mutacji (36). Heterozygotyczne myszy C67X KI rozwijają pogarszające się DI z wiekiem i progresywną, selektywną utratą neuronów wytwarzających AVP. Metody Celowanie genowe. Myszy AVP KI wytworzono przez rekombinację homologiczną w zarodkowych komórkach macierzystych R1 (41). Używając cDNA AVP myszy jako sondy,. Klony fagowe zawierające mysie geny Avp i oksytocyny (Oxt) wyizolowano z biblioteki genomowej A FIXII-129SvJ (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, USA). Wektory ukierunkowane na mutację peptydu sygnałowego A (a 1) T i mutację nonsensowną C67X skonstruowano, stosując odpowiednio fragmenty genomowego DNA 7,6- i 12,3 kb (Figura 1a). Mutacje A (a 1) T i C67X wprowadzono przez zachodzące na siebie PCR, tworząc odpowiednio miejsca restrykcyjne ScaI i NheI: kodony TCC (S) / GCC (A) zmieniono na AGT (S) ACT (T) i kodony CGC ( R) / TGC (C) / GCC (A) zmieniono na CGC (R) / TAG (X) / CCC. Do selekcji wprowadzono kasetę kinazy tymidynowej i kasetę neomycynową flankowaną przez miejsca loxP. Linearyzowany wektor celujący (40 .g) poddano elektroporacji do zarodkowych komórek macierzystych około 8 × 106 R1 (41), a komórki hodowano w obecności 300 .g / ml G418 (Invitrogen Corp., Gaithersburg, Maryland, USA) i 2. M gancyklowir (Hoffman. La Roche Inc., Nutley, New Jersey, USA). Homologiczną rekombinację potwierdzono zarówno za pomocą analizy Southern blot, jak i PCR. Siedem z 17 klonów dodatnich dla rekombinacji homologicznej dla mutacji A (a1) T i 17 z ponad 100 klonów pozytywnych dla mutacji C67X poddano następnie kariotypowaniu w celu zapewnienia prawidłowego składu chromosomalnego. Wstrzyknięcie blastocysty przeprowadzono w ośrodku transgenicznym (Children s Memorial Institute for Education and Research) (Chicago, Illinois, USA), stosując dwie zarodkowe klony komórek macierzystych dla każdej z mutacji. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Pielęgnacji i Używania Zwierząt Northwestern University. Figura Kierowana mutageneza mysiego genu Avp. (a) Strategia kierowania. Specyficzne mutacje i miejsca restrykcyjne wstawiono do eksonu [A (a1) T; ScaI] lub ekson 2 [C67X; NheI] przez rekombinację homologiczną. Dodatkowe miejsce XbaI (X *) powstaje po wycięciu Cre z kasety loxP-Neo-loxP z allelu T ukierunkowanego na A (a1). Wprowadzone miejsca restrykcyjne zastosowano do wykrywania zmutowanych genów WT Avp i mRNA Avp z odwrotną transkrypcją. Białe pudełka, eksony genów Avp; szare pola, eksony genu Oxt. X, XbaI; H, Hindlll; E, EcoRI; A, AccI. (b) Analiza Southern blot. Trawiony XbaI i trawiony ScaI genomowy DNA hybrydyzowano z sondą o długości 1214 bp (fragment Hindlll-EcoRI DNA), znakując strawiony XbaI DNA o długości 2375 pz dla normalnego allelu i 1,507 bp (XbaI-Scal) i 404 pz. (Fragmenty ScaI-Xbal *) dla zmutowanego allelu A (a 1) T. Trawienie EcoRI i NheI i hybrydyzacja z sondą 912 bp (fragment DNA XbaI-AccI) wyznakowało strawiony EcoRI 4578 pz dla normalnego allelu i 978 pz (EcoRI-NheI) i 3600 pz (NheI-EcoRI ) DNA dla zmutowanego allelu C67X. (c) Analiza RT-PCR do wykrywania WT i zmutowanych transkryptów Avp w podwzgórzu. CDNA o długości 366 bp obejmujące mutację A (A 1) T powielono stosując startery do przodu i do tyłu znajdujące się odpowiednio w eksonie i eksonie 2. Trawienie restrykcyjne za pomocą ScaI wygenerowało pasmo 366-bp z normalnego allelu i fragmenty 265- i 101-pz ze zmutowanego allelu. DNA obejmujący mutację C67X (267 pz) amplifikowano za pomocą starterów do przodu (ekson 2) i do tyłu (ekson 3). W wyniku trawienia NheI uzyskano fragmenty 163- i 104-pz pochodzące ze zmutowanego allelu. Analiza Southern blot. Fragment DNA Hindlll-EcoRI (1214 bp) obejmujący ekson mysiego genu Avp i fragment Xbal-Accl (912 bp) obejmujący egzony 2 i 3 zastosowano jako sondy do badania przesiewowych zarodkowych komórek macierzystych i potomstwa chimerycznych myszy niosących Mutacje A (a1) T i C67X, odpowiednio (Figura 1a). Całkowity genomowy DNA oczyszczony z fragmentów ogona trawiono XbaI i ScaI dla mutanta A (a 1) T i EcoRI i NheI dla mutanta C67X. Pokosty rozdzielono na 0,8% żelu agarozowym i przeniesiono na membranę Nytran stosując szybki system przenoszenia w dół TurboBlotter (Schleicher & Schuell BioScience GmbH, Dassel, Niemcy).
[podobne: jak sobie poradzić po rozstaniu, techniki relaksacyjne dla dzieci, olej kokosowy na włosy jak stosować ]
[więcej w: novision, rentierstwo, brian tracy international ]