Skip to content

Inhibitor IL-13 blokuje rozwój zwłóknienia wątroby podczas dominującej reakcji zapalnej typu T-helper typu 2 cd

1 tydzień ago

577 words

Tkanki wątroby zhomogenizowano w RNA-STAT 60 (Tel-Test Inc., Friendswood, Texas, USA), stosując polytron tkankowy (Omni International Inc., Warrenton, Virginia, USA) i całkowity RNA ekstrahowano zgodnie z zaleceniami producenta . Procedurę RT-PCR zastosowano do określenia względnych ilości mRNA dla kilku genów cytokin po odwrotnej transkrypcji .g RNA, jak opisano (36). Startery i sondy dla wszystkich genów zostały opublikowane wcześniej (13, 36, 37). Cykle PCR stosowane dla każdej cytokiny były następujące: IL-4 (33), IL-5 (31), IFN-a (29), TNF-a (34), prokolagen I (26), prokolagen III (22), TGF-a (34), TGF-a 2 (34) i fosforybozylotransferaza hipoksantynowo-guaninowa (HPRT) (23). Ilość produktu PCR określono przez porównanie stosunku gęstości sygnału specyficznego dla cytokiny z gęstością sygnału specyficzną dla HPRT dla poszczególnych próbek. Arbitralne jednostki densytometryczne dla poszczególnych próbek zostały następnie pomnożone przez współczynnik 100. Hodowle in vitro. Komórki węzłów chłonnych krezki (MLN) i śledziony ekstrahowano z myszy, a zawiesiny pojedynczych komórek przygotowano jak opisano wcześniej (9). Komórki umieszczono w pożywce RPMI-1640 (3 x 106 / ml, ml) uzupełnionej 10% FCS, 2 mM glutaminy, 100 U / ml penicyliny, 100 ug / ml streptomycyny, 25 mM HEPES, mM pirogronianu sodu, 0,1 mM nieistotnych aminokwasów i 50. M 2-ME w 37 ° C w 5% CO2. Komórki stymulowano SEA (20 .g / ml), a supernatanty zbierano po 72 godzinach. Dodatkowe stymulowane przez SEA kultury potraktowano również 50 .g / ml mAb anty-CD4 (GK1.5). IL-4, IL-5, IL-10 i IFN-a zostały zmierzone przy użyciu specyficznego testu kanapkowego ELISA (9). Poziomy IL-13 były mierzone przy użyciu zestawów ELISA mysiej IL-13 (R & D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA). Detekcja Western blot kolagenu I. Fibroblasty 3T3 hodowano w pożywce RPMI-1640 suplementowanej jak opisano powyżej. Konfluentne komórki wysiano na 24-studzienkowe płytki (500 000 komórek / ml) i stymulowano IL-4 (1000 U / ml) lub rIL-13 (20 ng / ml; R & D Systems Inc.). Supernatanty z hodowli zebrano w celu analizy wydzielonego kolagenu I. Komórki przemyto jednokrotnie PBS i poddano lizie buforem do próbek SDS-PAGE. Lizaty komórkowe i supernatanty z hodowli poddano rozdziałowi elektroforetycznemu w 6% żelu Tris-glicynowym (Novel Experimental Technology, San Diego, California, USA), stosując warunki redukujące i przeniesiono na membrany nitrocelulozowe (Schleicher & Schuell Inc., Keene, New. Hampshire, USA). Jako drugie przeciwciało zastosowano sondę z kolagenem IgG przeciwko mysiej myszy typu I (BIODESIGN International, Kennebunk, Maine, USA) i anty-króliczą IgG znakowaną peroksydazą (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey, USA). Prążki oglądano przy użyciu odczynnika chemiluminescencyjnego Western blot (NEN Life Science Products Inc., Boston, Massachusetts, USA). W celu potwierdzenia tożsamości pasm kolagenu, lizaty komórkowe traktowano 0,5 mg / ml kolagenazy (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA) w PBS uzupełnionym mM CaCl2 i 1% FCS, przez godzinę w 37 ° C. . Oczyszczony kolagen szczura I składający się z kolagenów A11 (I), 12 (I) i A (I), 2 (I) otrzymano z Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA) i stosowano jako kontrola. Statystyka. Wielkość ziarniniaka i zwłóknienie wątroby (dostosowane do liczby jaj) zmniejszają się wraz ze wzrostem intensywności infekcji (parami robaków) w tych i poprzednich eksperymentach. Zmienne te zostały zatem porównane przez analizę kowariancji, przy użyciu logu całkowitych jaj wątroby jako współzmiennej i log hydroksyproliny na jajo. Zmienne, które nie uległy zmianie wraz z intensywnością infekcji, porównywano w jednokierunkowej ANOVA lub w teście ucznia. Obciążenia robaka i jaja oceniano za pomocą testu sumy rang Wilcoxona, stosując test kombinacyjny Fishera, gdy połączono wyniki z 2 lub więcej eksperymentów. Zmiany w mRNA cytokin i wartości wydzielanych białek cytokiny określono za pomocą ANOVA. We wszystkich przypadkach wyniki uznano za istotne dla P <0,05. Wyniki Leczenie sIL-13Rc 2-Fc znacząco zmniejsza zwłóknienie wątroby u myszy zakażonych S. mansoni. Aby porównać regulacyjne role IL-4 i IL-13 w patogenezie schistosomatozy, zainfekowaliśmy myszy C57BL / 6 WT i IL-4 (3 przezskórnie 25 cerkanami S. mansoni. Oddzielne grupy zwierząt traktowano albo sIL-13R2 2-Fc, albo kontrolą Fc, jak opisano w Metodach. Zabiegi rozpoczęły się w piątym tygodniu, na początku składania jaj. Wszystkie zwierzęta uśmiercono 8 tygodni po zakażeniu i badano pod kątem kilku parametrów parazytologicznych i immunologicznych. Wszystkie 4 grupy myszy miały podobne obciążenia robakami, a jajeczka produkowane na parę robaków nie różniły się między grupami (Tabela 1) [hasła pokrewne: zostań rentierem opinie, choroba hashimoto a ciąża, poradnia osteoporozy warszawa ] [patrz też: choroba hashimoto a ciąża, novision, rentierstwo ]