Skip to content

Indukowane alkoholem wytwarzanie produktów peroksydacji lipidów u ludzi czesc 4

1 miesiąc ago

684 words

Próbki oczyszczono za pomocą TLC. Natywne i znakowane iPF2a-III były derywatyzowane jako ich estry pentafluorobenzylowe, etery trimetylosililowe. Następnie analizowano je za pomocą GC / MS w trybie jonów ujemnych jonizacji chemicznej. Wartości ilościowe wyrażono jako stosunek obszaru pod pikiem jonu, który reprezentuje związek endogenny, do tego w stosunku do wzorca wewnętrznego. Stężenie kreatyniny w moczu określono za pomocą standardowego automatycznego testu kolorymetrycznego, stosując system Beckman Synchron CX (Beckman Instruments Inc., Arlington Heights, Illinois, USA). 2,3-dinor-5,6-dihydro-iPF2a-III otrzymano w prezencie od Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, Michigan, USA). Związek 1802 wytworzono stosując metodę Picketta i Murphy ego (31). Pokrótce, wewnętrzny standard dodano do moczu zakwaszonego kwasem mrówkowym. Lipid wyekstrahowano ekstrakcją w fazie stałej na stanowisku RapidTrace SPE Workstation (Zymark Corp., Hopkinton, Massachusetts, USA). Próbkę naniesiono na kolumnę i przepłukano buforem o pH 7,0, a następnie ml octanu etylu, następnie osuszono pod N2 i ponownie rozpuszczono w 30 ul octanu etylu. Metabolit oddzielono od innych eikozanoidów metodą TLC (Whatman Inc., Clifton, New Jersey, USA), stosując ruchomą fazę 20% metanolu i 80% octanu etylu. Ponownie, związek derywatyzowano jako jego ester pentaflourobenzylowy, eter trimetylosililowy i analizowano na MD800 GC / MS (Finnigan Corp., San Jose, Kalifornia, USA). Moczowy iPF2a-VI mierzono podobnie, jak opisano poprzednio, wykorzystując zależną od pH laktonizację tej klasy iP (18). Analiza moczu 4-HNE. Metoda pomiaru 4-HNE w moczu została zaadaptowana z metody opracowanej wcześniej przez van Kuijka i in. (32) do pomiaru 4-hydroksyalkenali w utlenionym LDL. Pokrótce, 5-ml próbki moczu zostały wzbogacone 5 ng d3-HNE (dostarczone przez FJ van Kuijk, University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas, USA), dokładnie wymieszane i pozostawione do osiągnięcia równowagi przez 15 minut w temperaturze pokojowej . Następnie do każdej próbki dodano 2 mg chlorowodorku o- (2,3,4,5,6-pentafluorobenzylo) hydroksyloaminy i próbki pozostawiono na 30 minut w temperaturze pokojowej. 4-HNE ekstrahowano stosując wkłady ekstrakcji w fazie stałej w fazie odwróconej (C18 EC, 500 mg, International Sorbent Technology Ltd., Mid Glamorgan, Wielka Brytania) w następujących warunkach. Kartridż kondycjonowano 5 ml etanolu i przemyto 1,5 ml H2O. Próbkę załadowano na wkład, który przemyto 3 ml 60% etanolu. Kartridż wysuszono przez 10 minut, a próbkę eluowano 3 ml octanu etylu. Próbkę następnie wysuszono w strumieniu N2 i rozpuszczono w ml heksanu. W drugiej ekstrakcji zastosowano naboje ekstrakcyjne do fazy stałej w fazie stałej (100 mg krzemionki kondycjonowanej ml heksanu). Próbkę załadowano na nabój, który przemyto ml heksanu. Próbkę eluowano ml 30% octanu etylu w heksanie, wysuszono i rozpuszczono w 15 ul dodekanu. Jeden mikrolitr próbki wykorzystano do analizy GC / MS. Spektrometr masowy pracował w trybie jonizacji jonu ujemnego w trybie jonizacji elektronów, przy użyciu amoniaku jako gazu moderującego. Kontrolowane jony miały stosunek masy do ładunku (m / z) 283 i 286 odpowiednio dla 4-HNE i d3-HNE. Reprezentatywny chromatogram uzyskany z ludzkiego moczu przedstawiono na fig. 1. Zwiększone ilości d3-HNE (0,3, 0,625, 1,25, 2,5, 5 i 10 ng) dodano do 5 ml kontrolnych próbek moczu, z których 4-HNE było ekstrahowano jak opisano powyżej, w celu oceny liniowości testu. Figura 1Quentitation of 4-HNE w ludzkim moczu. Pięć mililitrów moczu dodano do 5 ng trouteryzowanego 4-HNE. Górny ślad (m / z 286) reprezentuje wewnętrzny standard; dolny ślad (m / z 283) reprezentuje endogenny 4-HNE. Każdy ślad jonowy pokazuje 2 piki (wypełniony pik i pik oznaczony gwiazdką), które pochodzą z syn i anty izomerów generowanych, gdy tworzy się pochodną pentafluorobenzyloksymu. Inne pomiary. Krew pobierano z żyły przedłokciowej, a stężenie etanolu mierzono za pomocą zestawu dehydrogenazy alkoholowej z Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA). Po ekstrakcji heksanem zmierzono stężenie witaminy C w osoczu i poziomy a-tokoferolu za pomocą HPLC na kolumnie C18 z odwróconą fazą (33). Surowicę ogrzewano kwasem tiobarbiturowym przy pH niższym niż 5,0 dla pomiaru TBARS. Otrzymany addukt malondialdehydu mierzono absorbancją przy 532 nm, jak opisano wcześniej (27). Analiza statystyczna. Dane początkowo poddano analizie ANOVA Kruskala-Wallisa, z późniejszą analizą parowania z zastosowaniem 2-biegunowego testu wolnego od dystrybucji, odpowiednio
[patrz też: ćwiczenia z hantlami na klate, marek kamiński blog, aparat ortodontyczny na raty ]
[hasła pokrewne: aparat ortodontyczny na raty, urolog dziecięcy rzeszów, jak sobie poradzić po rozstaniu ]