Skip to content

Indukcja przedłużonego przeżycia limfocytów T CD4 + za pomocą przerywanej terapii IL-2 u pacjentów zakażonych wirusem HIV ad 7

2 miesiące ago

772 words

Poziomy HIV w osoczu mierzono za pomocą testu VERSANT HIV-1 RNA 3.0 (Bayer HealthCare AG). W celu określenia włączenia deuteru, komórki T CD4 + krwi obwodowej i komórki T CD8 + wyizolowano przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencyjnie, stosując cytometr przepływowy EPICS ALTRA (Beckman Coulter Inc.) lub BD FACSVantage SE FACSDiVa (BD Biosciences), do ponad 99,0% czystość. Do analizy naiwnych i pamięci komórek T CD4 +, PBMC wzbogacono w komórki T CD4 + przez usunięcie monocytów i limfocytów CD8 + przy użyciu anty-CD14. i kulki magnetyczne powlekane anty-CD8 (Dynal Biotech). Limfocyty CD8 + usunięte w tym etapie zostały użyte później do sortowania dla pamięci CD8 + i naiwnych podzbiorów. Pozostałe limfocyty następnie barwiono zgodnie z instrukcjami producenta z mAb CD27-FITC (BD Biosciences), CD45RO-PE (BD Biosciences) i CD4-PC5 (Beckman Coulter Inc.). Sortowanie przeprowadzono przy użyciu amorficznego rozpraszania światła w przód i bramki rozpraszania światła 90 ° i prostoliniowych bramek na komórkach CD27 + CD45RO. CD4 + (naiwna), CD27 + CD45RO + CD4 + (pamięć centralna) i CD27. CD45RO + CD4 + (pamięć efektorowa); czystość podzbioru została określona za pomocą cytometrii przepływowej jako większa niż 98,0%. W przypadku komórek CD4 było za mało CD27. CD45RO. komórki do analizy. W celu wyizolowania komórek T CD8 + naiwnych i pamięci, limfocyty CD8 + usunięte przez rozdzielenie kulek potraktowano DETACHaBEAD (Dynal Biotech) w celu usunięcia dołączonych perełek magnetycznych. Następnie limfocyty CD8 + wybarwiono mAb CD27-FITC, CD45RO-PE i CD8-PC5 (Beckman Coulter Inc.). Sortowanie przeprowadzono jak powyżej z prostoliniowymi bramkami na CD27 + CD45RO . CD8 + (naiwny), CD27 + CD45RO + CD8 + (pamięć centralna), CD27y CD45RO + CD8 + (pamięć efektorowa) i CD27a CD45RO. CD8 + (komórki pamięci efektorowej); czystość podzbioru została określona jako większa niż 98,0%. Oznaczenie ilościowe wzbogacenia 2H-glukozy w surowicy i wzbogacenie 2H-dezoksyadenozyny w genomowym DNA. Glukozę ekstrahowano z surowicy metanolem i przekształcano w aldonitrylowe pochodne octanu glukozy (stosunek masy do ładunku [m / z] 217) i 2H-glukozy (219 m / z) do analizy spektralnej chromatografii gazowej / spektrometrii masowej przy użyciu chromatografu gazowego HP 5890 (Hewlett-Packard Co.) połączonego z detektorem masowym HP 5971 (Hewlett-Packard Co.) (23). Wzbogacone próbki obliczono przez porównanie z krzywymi wzorcowymi przygotowanymi z 2H-glukozy. Genomowy DNA poddano hydrolizie do mono-deoksyrybonukleozydów z deoksyrybonukleazą I, fosfodiesterazą I i bakteryjną fosfatazą alkaliczną, odsalano za pomocą 96-studzienkowej płytki do ekstrakcji Oasis HLB (Waters Corp.) i przekształcono w permetylowane pochodne dezoksyadenozyny (292 m / z) i 2H-dezoksyadenozynę (294 m / z) do analizy chromatografii gazowej / spektrometrii mas lub analizowane bezpośrednio za pomocą chromatografii cieczowej / spektrometrii masowej, jak opisano w odnośniku. 24. Próbki wzbogacono obliczając przez porównanie z krzywymi wzorcowymi przygotowanymi z 2H-dezoksyadenozyny. Aby określić ilość nowego DNA, który został zsyntetyzowany, eksperymentalnie określony procent wzbogacenia 2H-dezoksyadenozyny skorygowano, jak opisano wcześniej (9), aby uwzględnić następujące czynniki: (a) maksymalne znakowanie świeżo otrzymanych limfocytów hodowanych in vitro w obecność 100% 2H-glukozy, która wynosiła około 60%; i (b) poziom wzbogacenia 2H-glukozy w surowicy, typowo około 20% do 30%. Modelowanie i analiza statystyczna. Początkowo stałe zaniku zostały oszacowane przez regresję liniową danych przekształconych log przez pierwsze 120 dni po znakowaniu; dla 2 długoterminowych respondentów szacunki próchnicy były oparte na wszystkich dostępnych danych. Ponieważ regresja liniowa zapewniała stosunkowo słabe dopasowanie do rzeczywistych danych, opracowaliśmy model półempiryczny, aby lepiej opisać kinetykę i oszacować stałe zaniku. Wcześniej opracowaliśmy model dynamiki limfocytów T we krwi znakowanej BrdU, który został dopasowany do danych eksperymentalnych dla pacjentów zakażonych HIV ze stosunkowo stabilnym poziomem stężenia HIV w osoczu (11). Zgodnie z tym modelem, frakcję wyznakowanych komórek L w każdej subpopulacji komórkowej ze stałą szybkości obrotu d (wk. 1) i źródłem wyznakowanych komórek s (wk. L) można obliczyć jako dL / dt = sU. dL, gdzie U jest funkcją jednostkową zależną od czasu T wymaganego do osiągnięcia maksymalnej wartości L: Równanie1 Stwierdziliśmy wcześniej, że co najmniej 2 (prawdopodobnie 3 lub więcej) dynamicznie odrębnych subpopulacji komórkowych przyczynia się do dynamiki komórek T ( 11). Indywidualna zmienność stałych szybkości wśród pacjentów była stosunkowo duża, co sugeruje dalsze istnienie wielu subpopulacji komórkowych. Aby uwzględnić różnorodność dynamicznych stałych komórek, rozszerzyliśmy naszą wcześniejszą analizę, zakładając, że tempo obrotu d jest w sposób ciągły dystrybuowane z funkcją gęstości prawdopodobieństwa F (d ,.), gdzie. jest wektorem parametrów
[patrz też: bmi kalkulator dla dzieci, laserowe usuwanie zylakow, zostań rentierem opinie ]
[więcej w: urolog dziecięcy rzeszów, jak sobie poradzić po rozstaniu, ćwiczenia z hantlami na klate ]