Skip to content

IL-10 ma krytyczne znaczenie dla odpowiedzi Th2 w mysim modelu alergicznego zapalenia skóry cd

3 tygodnie ago

746 words

Supernatanty zebrano po 96 godzinach hodowli, odwirowano i zamrożono aż do użycia. IL-4 i IFN-y w supernatantach oznaczono metodą ELISA zgodnie z instrukcjami producenta (Pharmingen). Przygotowanie i priming in vitro naiwnych komórek T od transgenicznych myszy specyficznych dla OVA. Limfocyty T ze śledzion myszy transgenicznych OVA oczyszczono na kolumnach do wzbogacania komórek T myszy (R & D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA) i składały się z 90. 95% komórek CD3 +. APC składały się z napromieniowanych (28 Gy) splenocytów i były pulsowane przez godzinę w 37 ° C z 0,3 .M peptydu OVA323 a 339 (Genosys, The Woodlands, Texas, USA). Komórki T hodowano w 24-studzienkowych płytkach (106 komórek na studzienkę) pod nieobecność lub obecność APC (5 x 106 komórek na studzienkę) uzyskanych od myszy WT Balb / C lub IL-10 p / l. myszy na tle Balb / C. Komórki odzyskane z 5-dniowych hodowli dwukrotnie przemyto, odpoczywano przez kolejne 5 dni, a następnie ponownie stymulowano napromieniowanymi APC pulsowanymi peptydem OVA. Supernatanty zebrano po 24 godzinach i testowano na IL-4 i IFN-a. zawartość. Generowanie DC i eksperymenty transferu in vivo. DC wytworzono ze śledzion IL-10 (3 /. myszy i genetycznie dopasowane kontrole C57BL / 6. Osiem do 12 śledzion zostały pocięte na małe fragmenty. Fragmenty następnie trawiono kolagenazą D (1 mg / ml; Worthington Biochemical Corp., Freehold, New Jersey, USA) przez 25 minut w temperaturze pokojowej, a następnie traktowano 0,1 M EDTA (pH 7,2) przez 5 minut. Niestrawiony włóknisty materiał został usunięty. Komórki odzyskano z trawienia i przemyto. Komórki o gęstości światła wybrano przez odwirowanie w środowisku metrizamidu (1,068 g / cm3 pH 7,2, Sigma Chemical Co.). DC następnie dodatkowo wzbogacono przez oczyszczenie na mikrokulkach MACS CD11c (N418) (Miltenyi Biotec, Auburn, California, USA), a czystość była większa niż 90% CD11c +, jak określono metodą FACS. Dla eksperymentów przenoszenia in vivo, DC były pulsowane 50. G / ml OVA przez 18 godzin i wstrzyknięte iv myszom C57BL / 6 (5 x 105 komórek na mysz). Po 10 dniach splenocyty z myszy, które otrzymały DC (2 x 106 / ml) hodowano w kompletnym RPMI 1640 (JRH Biosciences Inc.) uzupełnionym mM pirogronianem sodu, 2 mM L-glutaminą, 0,05 mM 2-ME, 100 U / ml penicyliny, 100 .g / ml streptomycyny i 3% normalnej surowicy mysiej (Cedarlane Laboratories Ltd., Hornby, Ontario, Kanada) i stymulowane OVA (50 .g / ml). Supernatanty zebrano po 96 godzinach hodowli i testowano na IL-4 i IFN-y. W równoległym zestawie eksperymentów skórkę myszy, które otrzymały DC, ogolono, usunięto taśmę i poddano prowokacji OVA (100 .g w 100 .l normalnego roztworu soli) lub placebo (100 .l normalnego roztworu soli) i umieszczono na łatka sterylnej gazy. Trzy dni później skórę badano histologicznie i dla ekspresji cytokin jak opisano powyżej. Analiza statystyczna. Do porównania różnych grup myszy zastosowano nieparametryczny test U Manna-Whitneya, ponieważ odchylenia standardowe różniły się znacznie między grupami. Wartość AP mniejsza niż 0,05 została uznana za statystycznie istotną. Wyniki Odpędzanie taśmy indukuje szybką ekspresję mRNA IL-10 w normalnej skórze myszy. Usuwanie osadu z ogolonej skóry ma zasadnicze znaczenie dla uczulenia na EC, ponieważ stosowanie antygenu do depilacji, ale nie do obszywania taśmą, skóry lub do skóry bezwłosych myszy, nie powoduje skutecznego uczulenia (dane niepokazane). Użyliśmy konkurencyjnego testu RT-PCR do zbadania wpływu strip strippingu na ekspresję mRNA IL-10 w skórze myszy. Niskie poziomy mRNA IL-10 były wykrywalne w nieuszkodzonej skórze. Po ogolonej skórze sześć razy zdzierano taśmę, ekspresja mRNA IL-10 gwałtownie wzrastała, osiągając maksymalne poziomy w ciągu 2 godzin po urazie i powracając do normy po 48 godzinach (Figura 1). Figura 1IL-10 ekspresja mRNA w skórze myszy C57BL / 6 po sześcioodległym zdejmowaniu taśmy. (a) Wyniki reprezentatywnego eksperymentu. Plazmid pMUS i cDNA koamplifowano z użyciem polimerazy Taq, wytwarzając fragmenty PCR o wielkości 300 pz z plazmidu pMUS i fragmenty o długości 252 pz z cDNA IL-10. Równolegle próbki plazmidu i cDNA pMUS poddano koamplifikacji dla cDNA> 2m. Próbki były prowadzone na 1,6% żelu agarozowym i zabarwione bromkiem etydyny. (b) Połączone wyniki eksperymentów z użyciem sześciu myszy. Transkrypty cytokin oznaczono ilościowo za pomocą RT-PCR i wyrażono jako fg na 10 .g mRNA .2m. Kolumny i słupki błędów reprezentują średnią. SEM. Infiltracja eozynofili jest zmniejszona w miejscach skóry uwrażliwionych przez OVA IL-10. /. myszy. Naciek skórny z eozynofilami jest ważną cechą naszego modelu alergicznego zapalenia skóry wywołanego przez zastosowanie alergenu EC (30, 31)
[przypisy: choroba hashimoto a ciąża, laserowe usuwanie zylakow, aparat ortodontyczny na raty ]
[więcej w: bestia z wolfsberga cda, techniki relaksacyjne dla dzieci, zioła na odchudzanie ojca klimuszko ]