Skip to content

IL-10 ma krytyczne znaczenie dla odpowiedzi Th2 w mysim modelu alergicznego zapalenia skóry ad

1 tydzień ago

499 words

Mechaniczne uszkodzenie skóry przez drapanie jest ważną cechą AD i wykazano, że indukuje miejscową ekspresję mRNA IL-10 w ludzkiej skórze (29). Opracowaliśmy mysi model alergicznego zapalenia skóry wywołany uczuleniem na skórę (EC) za pomocą OVA (30, 31). Model ten wykazuje wiele cech ludzkiej AD, w tym podwyższone całkowite i swoiste IgE, zapalenie skóry charakteryzujące się infiltracją limfocytów T CD3 + i eozynofilów w skórze właściwej oraz zwiększoną miejscową ekspresją mRNA dla cytokin Th2. Zastosowaliśmy ten model do oceny roli IL-10 w alergicznym zapaleniu skóry. Metody Myszy i uczulenia. IL-10. /. myszy i myszy kontrolne WT o tym samym tle genetycznym C57BL / 6 otrzymano z The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA). IL-10. /. myszy na tle Balb / C były hojnym darem od Donny Rennick (DNAX, Palo Alto, Kalifornia, USA). Specyficzny dla OVA323A 339a i ograniczony do I-Ad . receptor komórek T DO11.10 . (TCR-a) transgeniczne myszy na tle Balb / C otrzymano z The Jackson Laboratory. Myszy kontrolne Balb / C pochodziły od Taconics (Germantown, New York, USA). Wszystkie myszy trzymano w środowisku wolnym od patogenów. Wszystkie procedury wykonywane na myszach były zgodne z Komisją ds. Opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywaniem w szpitalu dziecięcym. Uczulanie EC 4-6-tygodniowych samic myszy przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (30). Pokrótce, skórę znieczulonych myszy ogolono i taśmę pozbawiono sześciokrotnie przezroczystym opatrunkiem iv (Tegaderm; Owens & Minor Inc., Franklin, Massachusetts, USA). Sto mikrogramów OVA (Grade V, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) w 100 .l soli fizjologicznej lub placebo (100 .l soli fizjologicznej) umieszczono na łatce sterylnej gazy (1 × cm), który został przymocowany do skóry przezroczystym opatrunkiem bio-okluzyjnym. Każda mysz miała w sumie trzy 1-tygodniowe ekspozycje na plaster oddzielone od siebie w odstępach 2-tygodniowych. Do immunizacji śródotrzewnowej myszy wstrzyknięto w dniu 0 i 14 50 .g OVA w ałun i zabito w dniu 28. Analiza histologiczna. Próbki uzyskane z załatanych obszarów na skórze 24 godziny po plastrze z trzeciego uczulenia utrwalono w 10% zbuforowanej formalinie i zatopiono w parafinie. Wiele odcinków o długości 4 .m zabarwiono H & E. Poszczególne typy komórek zapalnych zostały policzone jako zaślepione w 15-20 polach o dużej mocy (HPF) na poziomie × 1,000. Skórować podstawowe białko podstawowe za pomocą analizy immunohistologicznej. Skrawki skóry były osadzone w związku Tissue-Tek oxacalcitriol (OCT) (Miles Laboratories Inc., Elkhart, Indiana, USA) na suchym lodzie. Skrawki o długości 4 .m zabarwiono metodą awidyna-biotyna, jak opisano poprzednio (32). Przeciwciało przeciw króliczym przeciwciało przeciw podstawowemu białku zasadowemu (anty-MBP) było miłym darem od Jamesa Lee (Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, USA) (33). Przygotowanie RNA i amplifikacja PCR odwrotnego transkrypcji cDNA (RT-PCR). Biopsje skóry uzyskano pod koniec trzeciego uczulenia i natychmiast zamrożono w suchym lodzie. Próbki homogenizowano w Trizol (GIBCO BRL, Life Technologies Grand Island, Nowy Jork, USA) stosując urządzenie Polytron RT-3000 (Kinematica AG, Littau, Szwajcaria). Ekstrakcję RNA przeprowadzono zgodnie z instrukcją producenta. cDNA zsyntetyzowano z 10 .g całkowitego RNA w 40 .l mieszaniny reakcyjnej stosując Superscript II (GIBCO BRL). Startery stosowane do amplifikacji cDNA dla <2m, IL-10, IL-4, IL-5 i IFN-y oraz amplifikacji DNA były jak opisano poprzednio (30). W celu ilościowego oznaczenia mRNA, kohortowano stałą ilość odwrotnego transkrybowanego komórkowego mRNA w obecności seryjnych rozcieńczeń wielospecyficznej wewnętrznej kontroli plazmidu, pMUS3 (34), która zawiera sekwencje nukleotydowe wielu cytokin. Oznaczenie ilościowe mRNA z cytokinami przeprowadzono jak opisano wcześniej (31), a wyniki wyrażono jako stosunek cDNA cytokiny do cDNA o masie cząsteczkowej . 2m. Test ochrony przed RNazą. Szablon wieloskładnikowy mCK-5 (BD Pharmingen, San Jose, Kalifornia, USA) zawierający szablony DNA dla chemokiny, limfotaktyny, RANTES, eotaksyny, makrofagowych białek zapalnych-1 (MIP-1), MIP-2, MIP-1 ., IFN- indukowalne białko-10 (IP-10), białko chemotaktyczne monocytów-1 (MCP-1) i TCA-3, oraz dla genów uspokajających L32 (rybosomalne RNA) i GAPDH. Test przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta. Szablony DNA znakowano [32P] UTP (3000 Ci / mmol, 10 CiC / ll, PerkinElmer Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA) i hybrydyzowano przez noc z 20 .g całkowitego RNA (z zebranych próbek sześciu myszy w każdej grupie), a następnie trawienie RNazą A i T1. IL-4 in vitro i IFN-y synteza. Zawiesiny pojedynczych komórek śledziony wytworzono w kompletnej RPMI 1640 (JRH Biosciences Inc., Lenexa, Kansas, USA) uzupełnionej 10% FCS, mM pirogronianem sodu, 2 mM L-glutaminą, 0,05 mM 2-ME, 100 U / ml penicyliny i 100 .g / ml streptomycyny [patrz też: olejek arganowy gdzie kupić, jak sobie poradzić po rozstaniu, laserowe usuwanie zylakow ] [hasła pokrewne: sukces definicja, marek kamiński blog, poradnia osteoporozy warszawa ]