Skip to content

Identyfikacja ludzkiej mutacji synaptotagminy-1, która zaburza krążenie pęcherzyków synaptycznych czesc 4

2 miesiące ago

766 words

Spośród tych wariantów, 6 zidentyfikowano jako niekodujące warianty sekwencji (intronowa, sekwencja 3. UTR lub w genie niekodującym). Z pozostałych 3 wariantów 2 zidentyfikowano jako powszechne polimorfizmy rs649216 i rs145771593, pozostawiając pojedynczy heterozygotyczny wariant de novo do dalszej analizy przy (chr12: 79842738, hg19) w obrębie SYT1. Hybrydyzujący odmioniony de novo wariant, który powoduje podstawienie izoleucyna-to-treonina w pozycji 368 (I368T) został potwierdzony przez sekwencjonowanie Sangera (Figura 3). Rysunek 3 Identyfikacja, potwierdzenie i analiza ewolucyjna wariantu SYT1 de novo. (A) Analiza sekwencji zagrożenia potwierdzająca wariant SYST1 de novo. Chromatogramy sekwencji wykazują obecność wariantu w probandzie i allelu referencyjnym u obojga rodziców. (B) Wyrównanie sekwencji białkowych SYT1 o różnych grupach, pokazujących pozycję mutacji I368T w absolutnie zachowanej reszcie izoleucyny w obrębie wysoce konserwatywnego regionu sekwencji aminokwasowej. Wariant jest nieobecny w danych 1000 genomów (22), ponad 13 000 alleli z serwera Exome Variant (http://evs.gs.washington.edu/EVS/) i ponad 122 000 alleli z kohorty ExAC (http : //exac.broadinstitute.org/). Ten wariant był unikalny w kohorcie UK10K n = 9464 alleli u 4 732 pacjentów z szerokim zakresem diagnoz klinicznych (zestawy próbek do badań neurologicznych i dobrostanu UK10K Otyłość). Dokładniej, zestaw próbek neurorozwoju zawierał 2 598 osób z autyzmem lub schizofrenią. Dodatkowa grupa 1425 przypadków z niepełnosprawnością intelektualną, z których 160 przypadków miało powiązane zaburzenie ruchowe, została przebadana pod kątem tego wariantu i nie zidentyfikowano żadnych dalszych przypadków. Ponadto nie zgłoszono żadnych przypadków w projekcie DECIPHER, w którym sam SYT1 został usunięty lub zduplikowany (https://decipher.sanger.ac.uk/). Dane te wskazują, że obserwowany u pacjenta wariant I368T jest niezwykle rzadkim zdarzeniem mutacyjnym. Analiza częstotliwości kodujących wariantu w ludzkim SYT1 w publicznie dostępnych bazach danych (ExAC, EVS) wykazuje znaczny brak zmienności w tym białku, ponieważ istnieje tylko jeden polimorfizm kodujący zarejestrowany przy V420I w obrębie 2 aminokwasów z 3. koniec białka 422 aminokwasów. Wariant I368T znajduje się w obrębie regionu wiążącego wapń C2B białka SYT1, który jest silnie konserwowany w trakcie ewolucji, z izoleucyną w pozycji 368 całkowicie zachowaną od Drosophila melanogaster dla kręgowców (Figura 3). Wariant SYT1 I368T wpływa zarówno na egzocytozę SV, jak i na endocytozę. W celu określenia, czy wariant de novo SYT1 zidentyfikowany w probandzie zmienia funkcję presynaptyczną, zbadaliśmy wpływ ekspresji szczurzego SYT1 zawierającego równoważną mutację (odpowiadającą I367T u szczura) w pierwotnych hodowlach neuronów hipokampa myszy WT. WT SYT1 i zmutowany SYT1 (I368T) znakowano na ich N-końcowej domenie luminalu za pomocą pH fluoriny, zielonego białka fluorescencyjnego o zwiększonej wrażliwości na pH (23), aby umożliwić wizualizację ich wewnątrzkomórkowej lokalizacji i kwantyfikacji recyklingu SV. W przypadku ekspresji w neuronach, lokalizacja zmutowanego SYT1I368T-pH fluoriny była identyczna z tą dla SYT1WT-pH fluoriny, co wskazuje na normalne kierowanie do terminali nerwowych (Figura 4, A i B). Znalazło to odzwierciedlenie w podobnym współczynniku zmienności zarówno dla SYT1WT-pH fluoriny, jak i dla fluorytolu SYT1I368T, który zgłasza, w jaki sposób punktowy jest ich rozkład wzdłuż aksonu neuronalnego (24): (SYT1WT-pH-fluorin 116,2 -,3; SYT1I368T-pH-fluorin 124,0. 7,5, n = 3 dla obu; P = 0,50). Zarówno fluorozyna SYT1WT, jak i fluorozyna SYT1I368T ulegały ekspresji do równoważnych poziomów, przy czym całkowity poziom ekspresji SYT1 wzrósł o około 1,6- do 1,8-krotnie w stosunku do endogennego SYT1 (krotność ekspresji w stosunku do endogennej: SYT1WT-pH fluorin 1,60. 0,14, n = 3; SYT1I368T -fluoron 1,77. 0,18, n = 4, P = 0,53). Zatem mutant SYT1I368T ulega ekspresji w neuronach myszy w przybliżeniu równej proporcji do endogennej SYT1 (naśladując heterozygotyczną naturę wariantu w probandzie). Ryc. 4 Wpływ mutacji I368T na lokalizację SYT1 i trafficking zależny od aktywności. (A i B) Neurony hipokampa transfekowano albo SYT1WT-pH fluoriną albo fluorymetrem SYT1I368T. Reprezentatywne obrazy wykazują podobne punktowe rozmieszczenie fluorozyny SYT1WT (WT, A) i fluorozyny SYT1I368T (I368T, B) wzdłuż segmentów aksonalnych po ekspozycji na bufor do obrazowania alkalicznego. Obraz jest wyświetlany w fałszywym kolorze, a cieplejsze kolory wskazują na większą intensywność fluorescencji. Strzałki reprezentują lokalizację obu reporterów pH fluorin w terminalach nerwowych. Pasek skali: .m. (C i D) Transfekowane neurony stymulowano pociągiem o 1200 potencjałach czynnościowych przy 10 Hz w obecności 1. M bafilomycyny, aby zapobiec ponownemu zakwaszaniu pęcherzyków, a następnie poddano działaniu NH4Cl, aby ujawnić całkowitą fluorescencję fluorymu (n = 8 WT, n = 6). I368T)
[patrz też: zostań rentierem opinie, ćwiczenia z hantlami na klate, poradnia osteoporozy warszawa ]
[podobne: jak sobie poradzić po rozstaniu, ćwiczenia z hantlami na klate, laserowe usuwanie zylakow ]