Skip to content

Ekspresja funkcjonalnych receptorów chemokiny CXCR4 na ludzkich komórkach nabłonka okrężnicy czesc 4

2 miesiące ago

735 words

Pokazany eksperyment jest reprezentatywny dla co najmniej 3 niezależnych eksperymentów. Białko CXCR4 ulega ekspresji na powierzchni komórek HT-29. Ekspresję CXCR4 na powierzchni komórki oceniono za pomocą analizy FACS komórek HT-29 przy użyciu swoistego przeciwciała przeciwko CXCR4 (Figura 2). Nastąpiło przesunięcie intensywności fluorescencji komórek, które były leczone przeciw-CXCR4, w porównaniu z przeciwciałem kontrolnym izotypu. W 3 niezależnych eksperymentach CXCR4 został wyrażony przez 48. 7% (średnia . SD) komórek HT-29. Ten sam odsetek komórek zabarwionych niezależnie od tego, czy komórki rosły, czy nie. Figura 2Powierzchniowa ekspresja CXCR4 na komórkach HT-29. Komórki HT-29 inkubowano z 10 .g / ml anty-CXCR4 (wypełnione) lub przeciwciałem kontrolnym izotypowo (otwartym), a następnie znakowano koniugatem FITC. Przemyte komórki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej, w której zakumulowane zdarzenia bramkowano względem kontroli izotypowej. Pokazany eksperyment jest reprezentatywny dla 3 podobnych eksperymentów. Wpływ chemokin CXC i CC na zmianę [Ca2 +] i w komórkach HT-29. Aby określić, czy komórki HT-29 wyrażają jakiekolwiek funkcjonalne receptory chemokin, badano chemokiny pod kątem ich zdolności do indukowania zmian w [Ca2 +]. Wzrost poziomu cytozolowego [Ca2 +] i stymulowany chemokiną jest charakterystyczną reakcją większości receptorów chemokinowych leukocytów. Duży wzrost przejściowego podwyższenia Ca2 + indukowano w komórkach HT-29 w odpowiedzi na 12,5 nM SDF-1 (3, ligand dla CXCR4 (Figura 3a). Szereg innych chemokin badano również przy 12,5 nM, w tym IP-10, Mig, MIP-1 (3, MCP-1, IL-8, RANTES i eotaksyna; żaden z nich nie dał odpowiedzi. Było to zgodne z brakiem mRNA za pomocą analizy RT-PCR (wyników nie pokazano). Odpowiedź na SDF-1. był zależny od stężenia, z optymalnym podniesieniem [Ca2 +] i 89. 12,6 nM (średnia . SEM, n = 14) z 25 nM SDF-1. (Figura 3b). Figura 3Ca2 + strumień w komórkach HT-29 w odpowiedzi na SDF-1 .. (a) Zwiększenie wewnątrzkomórkowego Ca2 + indukowanego w komórkach HT-29 obciążonych fura-2 / AM. w odpowiedzi na stymulację 12,5 nM SDF-1 .. (b) Odpowiedź na SDF-1. jest zależny od stężenia. Podwielokrotności komórek HT-29 obciążonych fura-2 / AM stymulowano SDF-1. w stężeniach od 0,4 do 50 nM. Wyniki są średnie [Ca2 +] i dla pomiarów 3. 14 (. SEM). SDF-1. indukuje ekspresję mRNA ICAM-1 w komórkach HT-29. Chociaż wskazanie, że receptory CXCR4 na komórkach HT-29 są w stanie sygnalizować, pomiar zwiększonego przejściowego Ca2 + nie wskazuje, jaki może być wynik czynnościowy w komórce nabłonkowej. W związku z tym postanowiliśmy sprawdzić, czy SDF-1 (3, jedyny znany ligand dla CXCR4, może indukować jakiekolwiek czynniki, które mogą być związane z procesami zapalnymi. Linie komórek nabłonka okrężnicy wyrażają niski poziom podstawowej międzykomórkowej cząsteczki adhezyjnej ICAM-1, którą można regulować w górę za pomocą prozapalnych cytokin. Użyliśmy analizy Northern, aby określić, czy SDF-1. może również zwiększać ekspresję ICAM-1. Jak pokazano na fig. 4, 25 nM SDF-1. zwiększoną ekspresję mRNA ICAM-1 po 6 godzinach, z maksymalną ekspresją po 24-godzinnej ekspozycji. Rysunek 4SDF-1. wzmacnia ekspresję mRNA ICAM-1 w komórkach HT-29. Komórki HT-29 były głodzone w surowicy przez 24 godziny, a następnie traktowane między a 48 godzin 25 nM SDF-1 (3, przed wyekstrahowaniem RNA. Bloty badano na mRNA ICAM-1. Analiza densytometryczna wykazuje maksymalną ekspresję po 24 godzinach. Równe obciążenie pokazuje barwienie bromkiem etydyny 18S i 28S rybosomalnego RNA (dolny panel). Przedstawiony wynik jest reprezentatywny dla 2 podobnych eksperymentów. Maślan sodu hamuje ekspresję mRNA CXCR4 w komórkach HT-29. Ponieważ SDF-1. jest wyrażona w jelicie grubym konstytutywnie rozważaliśmy możliwość, że SDF-1. i CXCR4 może odgrywać rolę w utrzymaniu prawidłowej fizjologii okrężnicy. Okrężnica jest stale odnawiającą się tkanką i jako taka, proliferacja komórek nabłonkowych musi być ściśle kontrolowana. Utrzymywanie liczby komórek wymaga równowagi między proliferacją, różnicowaniem i apoptozą. Ta równowaga jest kontrolowana przez czynniki endogenne i mogą na nią wpływać czynniki dietetyczne, takie jak krótkołańcuchowy maślan kwasu tłuszczowego, który jest produktem fermentacji błonnika pokarmowego. 24-godzinne traktowanie 5 mM maślan sodu spowodowało zwiększoną aktywność fosfatazy alkalicznej szczotki w komórkach HT-29 (wyniki nie pokazane). Wskazuje to, że komórki zaczęły się różnicować. Analiza Northern wykazała, że ekspresja transkryptu mRNA CXCR4 o wielkości 1,8 kb była całkowicie hamowana przez traktowanie 5 mM maślanu w czasie od 3 do 24 godzin. Nie miało to wpływu na ekspresję genu uspokajającego p-aktyny (Figura 5). Figura 5 Ekspresja mRNA dla CCRCR4 w komórkach HT-29 jest redukowana przez maślan sodu
[podobne: laserowe usuwanie zylakow, definicja sukcesu, choroba hashimoto a ciąża ]
[patrz też: zioła na odchudzanie ojca klimuszko, bmi kalkulator dla dzieci, aparat ortodontyczny na raty ]