Skip to content

Ekspresja funkcjonalnych receptorów chemokiny CXCR4 na ludzkich komórkach nabłonka okrężnicy cd

2 miesiące ago

723 words

Komórki przemyto 3 razy PBS / 1% FBS / 0,1% azydku, a następnie inkubowano z rozcieńczeniem 1: 1000 przeciwciała przeciwko mysiemu IgG2a fluoresceinemu skoniugowanemu z izotiocyjanianem (Sigma-Aldritch) przez 30 minut. Komórki ponownie przemyto i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej na sortowniku komórek FACS Vantage (Becton Dickinson, Oxford, Wielka Brytania), stosując wzbudzenie przy 488 nm i emisję fluorescencji przy 520 nm. Analiza Northern blotting. Całkowity RNA ekstrahowano z komórek HT-29 w RNAzolu, jak opisano powyżej. Około 10 .g RNA załadowano na ścieżkę 1% żelu agarozy / formaldehydu. RNA przeniesiono na membrany nylonowe metodą kapilarnej i utrwalono przez wypalanie w temperaturze 120 ° C. Błony hybrydyzowano przez noc w 42 ° C z sondą znakowaną digoksygeniną przeciwko CXCR4 (Eurogentech, Abington, Wielka Brytania), ICAM-1 lub. -Actin (R & D Systems Europe Ltd., Abington, Wielka Brytania). Niezwiązaną sondę usunięto przez przemycie przez 10 minut w 2 x SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M cytrynian sodu, pH 7,0) i przez 10 minut w 0,1 x SSC (15 mM NaCl, 1,5 mM cytrynian sodu, pH 7,0). Związaną sondę wykrywano przy użyciu przeciwciała anty-DIG Fab skoniugowanego z fosfatazą alkaliczną i substratu chemiluminescencyjnego, CSPD (Roche Molecular Biochemicals), który wykryto przez ekspozycję na błonę rentgenowską. Immunohistochemia. Próbki biopsji okrężnicy błony śluzowej jelita grubego od pacjentów poddanych kolonoskopii z powodu choroby uchyłkowej (n = 6), gruczolakoraka okrężnicy (n = 9) oraz od osób zdrowych (n = 5) badano immunohistochemicznie pod kątem obecności receptora chemokiny CXCR4 w ludzkiej okrężnicy nabłonek. W rutynowym badaniu histopatologicznym próbki miały normalny nabłonek i normalną liczbę komórek kubkowych; morfologia i liczba gruczołów były prawidłowe i nie wykazywały żadnego zapalnego nacieku blaszki właściwej (21). Ponadto badano biopsję zapalnej błony śluzowej okrężnicy u pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego (n = 14) poddanych kolonoskopii diagnostycznej w kierunku ekspresji CXCR4. Wszyscy pacjenci z UC zostali niedawno zdiagnozowani z umiarkowaną do ciężkiej działalności choroby w czasie kolonoskopii. Pacjentów badano przed leczeniem, a próbki biopsji pobierano z obszarów największego udziału procesu zapalnego. Rutynowa histologia tych próbek wykazała owrzodzenie, zubożenie mucyny, deformację gruczołów, ropnie krypt i naciek zapalny blaszki właściwej (21). Oczyszczone mysie przeciwciało przeciwko ludzkiemu mAb przeciwko receptorowi chemokinowemu Fusin / CXCR4 zastosowano w metodzie streptawidyna / biotyna w celu wykazania obecności CXCR4 w ludzkim nabłonku okrężnicy. Próbki biopsji, które utrwalono w formalinie i zatopiono w parafinie, zamontowano na szkiełkach powlekanych 3-amino-propylotrietoksylo-silanem. Odparowane parafinowo sekcje parafinowe umieszczono w szybkowarze ciśnieniowym zawierającym 0,01 M buforowany roztwór cytrynianu sodu (pH 6), gotowano przez 2 minuty i schłodzono do temperatury pokojowej w celu odzyskania antygenów (22). Zamontowane szkiełka inkubowano następnie przez godzinę w temperaturze pokojowej z przeciwciałem przeciw ludzkiemu CXCR4 rozcieńczonym 1: 100 (10 mg / ml). Hematoxylinę Harrisa zastosowano jako barwnik kontrastowy. Kontrolne sekcje z sąsiednich skrawków wybarwiono mysim IgG2a dopasowanym izotypowo przeciwciałem (Sigma) w tych samych warunkach dla określenia specyficzności wiązania przeciwciała. Wyniki Różnicowa ekspresja mRNA receptora chemokinowego w komórkach HT-29. RT-PCR przeprowadzono na komórkach HT-29 pozbawionych surowicy z użyciem starterów dla receptorów chemokin CCR1aC0R10, CXCR1aCXCR5 i receptorów dla limfotaktyny i frakcjoniny. Pary primerów zostały sprawdzone poprzez zbadanie ich ekspresji w leukocytach przygotowanych z ludzkiej krwi lub w linii komórkowej Jurkat (dla CCR8 i CCR9 / 10). Figura pokazuje wyniki reprezentatywnego eksperymentu, który został powtórzony co najmniej 3 razy z komórkami o różnych liczbie pasaży. Jedynym receptorem, który ma być konsekwentnie wyrażany po 30 cyklach PCR przy zastosowaniu warunków przedstawionych w sekcji Metody, był SDF-1. receptor, CXCR4 (fusin / LESTR). Produkt PCR sekwencjonowano i pokazano, że jest identyczny z oczekiwaną sekwencją CXCR4. Żaden z pozostałych zbadanych mRNA receptorów chemokin nie został konsekwentnie wykryty. Identyczne wyniki uzyskano, gdy eksperymenty te powtórzono z użyciem komórek HT-29 pozbawionych surowicy (nie pokazano). Figura Ekspresja mRNA receptora chemokinowego w komórkach HT-29. Analiza PCR została przeprowadzona przy użyciu starterów przeciwko receptorom chemokin CCR1-9 / 10 i CXCR1-5 z GAPDH jako sondą służącą do porządkowania, jak opisano w Methods. Mieszany preparat leukocytów (lub Jurkats) zastosowano jako kontrolę pozytywną, jak pokazano na górnym panelu. Komórki HT-29 wyrażały CXCR4, jak pokazano na środkowym panelu, a kontrola negatywna (mRNA HT-29, który nie był odwrotnie transkrybowany) był konsekwentnie ujemny, jak pokazano na dolnym panelu
[hasła pokrewne: jak sobie poradzić po rozstaniu, zostań rentierem opinie, techniki relaksacyjne dla dzieci ]
[przypisy: poradnia osteoporozy warszawa, bestia z wolfsberga cda, techniki relaksacyjne dla dzieci ]