Skip to content

Ekspresja funkcjonalnych receptorów chemokiny CXCR4 na ludzkich komórkach nabłonka okrężnicy ad

1 miesiąc ago

333 words

Zdolność członków rodziny receptorów chemokin, w tym CCR3, CCR5 i CXCR4, do działania jako kofaktory infekcji HIV (19), zwiększa możliwość, że ekspresja tych receptorów w nabłonku może odgrywać rolę w infekcji wirusowej komórek nabłonka. W tym badaniu szukaliśmy ekspresji receptora chemokin w ludzkim nabłonku okrężnicy pod kątem potencjalnej roli receptorów chemokin w normalnej fizjologii nabłonka i jelitowej homeostazie, jak również w infekcji jelit i zapaleniu. Metody Odczynniki. SDF-1. został dostarczony przez Gryphon Sciences (San Francisco, Kalifornia, USA). Inne chemokiny i IL-1. pochodziły od Peprotec EC Ltd. (Londyn, Wielka Brytania). TNF-. był prezentem od Bayer (Slough, Wielka Brytania). Wszystkie odczynniki do hodowli komórkowej i unieczynniony termicznie FBS (HI-FBS) pochodziły z GIBCO BRL (Paisley, Zjednoczone Królestwo). Startery oligonukleotydowe zostały zsyntetyzowane przez Perkin Elmer (Applied Biosystems Warrington, Wielka Brytania). Przeciwciało 12C5 anty-CXCR4 pochodziło z PharMingen (San Diego, Kalifornia, USA). Standardowe odczynniki pochodziły z firmy Sigma-Aldrich Co. (Poole, Dorset, Wielka Brytania) lub Fisons Chemicals (Loughborough, Wielka Brytania). Hodowlę komórkową. Linię komórek nabłonka okrężnicy HT-29 otrzymano z European Collection of Animal Cultures (ECACC, Salisbury, Wiltshire, United Kingdom). Komórki HT-29 są nabłonkową linią komórkową pochodzącą z gruczolakoraka okrężnicy, która ma cechy normalnego nabłonka jelitowego (20). Komórki pasażowano co tydzień i hodowano w temperaturze 37 ° C w pożywce McCoya 5A uzupełnionej 10% FBS, penicyliną / streptomycyną (odpowiednio 10 U / ml i 10 ug / ml) i Fungizonem (0,5 ug / ml). . Aby komórki stały się nieaktywne, surowicę usunięto 24 godziny przed eksperymentem. Pomiar wewnątrzkomórkowego podwyższenia Ca2 +. Komórki HT-29 przemyto PBS i krótko eksponowano na 0,05% trypsynę / 0,02% EDTA w celu oderwania komórek z kolb hodowlanych. Aktywność trypsyny zahartowano przez przemycie w pożywce zawierającej 10% FBS. Następnie komórki płukano w HBSS zawierającym mM Ca2 + i Mg2 + i mg / ml BSA, a następnie nakładano w 37 ° C przez 30 minut barwnikiem-podstawnikiem Ca2 +, 5. M fura-2 / AM (Calbiochem-Novabiochem, Nottingham, Zjednoczone Królestwo). Komórki zostały przemyte i ponownie zawieszone do × 5 × 106 komórek mL <1. Strumień Ca2 + mierzono w odpowiedzi na chemokiny przy użyciu spektrofluorometru o podwójnej długości fali PTI (Photon Technology International, Surbiton, Surrey, Wielka Brytania) z wzbudzeniem przy 340 i 380 nm i emisji przy 510 nm. Eksperymenty powtarzano również przy użyciu komórek adherentnych z światłowodową prowadnicą światła, aby oświetlić szkiełko mikroskopowe. RT-PCR. Całkowity RNA ekstrahowano z 5 x 106 komórek HT-29 (lub innych pierwotnych komórek ludzkich wykorzystywanych jako kontrola) do RNAzolu (Tel-Test Inc., Friendswood, Texas, USA), jak opisali producenci. Biopsje pobrane z nieodświetlonych regionów ludzkiej okrężnicy zebrano do jałowej pożywki do hodowli tkankowej i homogenizowano do RNAzolu w ciągu godziny. Poli (A) + RNA oczyszczono przy użyciu zestawu do szybkiego oczyszczania (Quick Amp) (Amersham Pharmacia Biotech, St Albans, Hertfordshire, Wielka Brytania). Sto nanogramów mRNA denaturowano w 70 ° C przez 10 minut w obecności 5. M oligo (dT) 12-18 startera. Następnie poddano odwrotnej transkrypcji w objętości 10 (3 L za pomocą Superscriptu II (GIBCO BRL), buforu x RT, mM trifosforanów deoksyrybonukleotydów (dNTP), 5 mM ditiotreitolu (DDT) i 2,5 U / p RNAsin (Promega Corp ., Southhampton, Wielka Brytania) w 42 ° C przez 60 minut. Jednokililitrowe porcje cDNA zamplifikowano przez PCR w reakcji 25-P L, zawierającej 1x bufor PCR i 2 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 0,5. M sensowne i antysensowne startery i 0,4 U High Fidelity Expand polimeraza (Roche Molecular Biochemicals , Lewes, Sussex, Zjednoczone Królestwo). Sekwencje oligonukleotydów i wielkość produktu dla każdej pary starterów specyficznych dla genu pokazano w Tabeli 1. Warunki do amplifikacji były następujące: 5 minut w 94 ° C, 30 cykli 30 sekund w 94 ° C, 30 sekund w 56 ° C lub 60 ° C, 30 sekund w 72 ° C, a następnie przedłużanie przez 7 minut w 72 ° C. Produkty PCR rozdzielono przez elektroforezę na 2% żelach agarozowych i oglądano przez barwienie bromkiem etydyny. Ponieważ geny receptorów chemokin nie zawierają sekwencji intronów w celu kontroli pod kątem zanieczyszczenia genomowego, przeprowadzono identyczną równoległą reakcję PCR, zawierającą materiał wyjściowy, który nie został poddany odwrotnej transkrypcji. Tabela Startery PCR Cytometria przepływowa. Komórki HT-29 oderwano od kolb hodowlanych przez krótką ekspozycję na 0,05% trypsynę / 0,02% EDTA i przemyto PBS zawierającym 1% FBS / 0,1% azydek sodu. Komórki inkubowano w temperaturze pokojowej przez godzinę z 10 .g / ml przeciwciała anty-CXCR4 (klon 12G5; PharMingen) lub z dopasowanym izotypowo przeciwciałem kontrolnym. [hasła pokrewne: olej kokosowy na włosy jak stosować, sukces definicja, zostań rentierem opinie ] [patrz też: zostań rentierem opinie, sukces definicja, marek kamiński blog ]