Skip to content

Dysfunkcja śródbłonka w mysim modelu łagodnej hiperhomocysty (e) czesc 4

1 tydzień ago

556 words

Aorty usunięto z myszy CBSA / + i CBS + / + i oczyszczono z przydanki. Naczynia następnie umieszczono w zrównoważonym roztworze soli zawierającym glukozę (BSSG, skład: 65 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 0,25 mM MgCl2, 0,75 mM CaCl2, 10 mM Na-HEPES, 22 mM H3PO4 i 10 mM glukozy [pH 7,4 ]) i pozostawiono do osiągnięcia stanu równowagi przez 45 minut w 37 ° C poniżej 5% CO2. Naczynia następnie inkubowano przez 15 minut, w ciemności, w 5. M roztworze lucigeniny / BSSG. Chemiluminescencję Lucigenin mierzono w ciemni przy użyciu luminometru Turner Designs TD-20e w 15-sekundowych odstępach 20 razy w ciągu 5 minut. Następnie odjęto chemiluminescencję tła i pomiary standaryzowano stosując standardową krzywą wytwarzania nadtlenków znaną z ilości oksydazy ksantynowej i ksantynowej. Naczynia suszy się przez 24 godziny pod lampą grzejną w celu oznaczenia suchej masy. Wytwarzanie nadtlenków wyrażono jako. Mol O2 na 5 minut na miligram suchej masy tkanki aorty. Jako potwierdzenie danych uzyskanych dla lucigeniny, przeprowadziliśmy badania z użyciem testu cytochromu C (25). Ocena histologiczna. Tkanki, w tym serce, aortę i krezkę, wycięto z myszy CBSa / + i CBS + / + w wieku około 10 tygodni. Tkanki utrwalono w 4% formalinie, zatopiono w parafinie i skrawki wybarwiono hematoksyliną i eozyną i trichromem Massona. Immunohistochemia dla syntazy NOb śródbłonka i dla 3-nitrotyrozyny. Tkanki poddano deparafinizacji (ksylen 2 x, toluen x, 100% etanol 2 x, 95% etanol, 70% etanol, dejonizowana H2O i PBS [pH 7,4]) i inkubowano z 3% H2O2 przez 5 minut. Po przemyciu PBS tkankę inkubowano z blokującym roztworem 8% BSA przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po przemyciu PBS, szkiełka inkubowano z 10 .g / ml pierwotnego przeciwciała do eNOS (Transduction Laboratories, Lexington, Kentucky, USA) przez noc w 4 ° C. Po przemyciu szkiełek (PBS), zastosowano przeciwciało drugorzędowe (zestaw Vectastain z mysim biotynylowanym drugorzędowym przeciwciałem, Vector Laboratories, Burlingame, California, USA) i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Tkanki eNOS wizualizowano przy użyciu metody substratu DAB, jak opisano w zestawie substratów DAB firmy Vector Laboratories. Slajdy zostały zamontowane i uszczelnione w celu wizualizacji mikroskopowej. Wytwarzanie peroksynitrytu oceniano na podstawie obecności stabilnego produktu końcowego w jego oddziaływaniu z komórkowymi resztami tyrozyny, 3-nitrotyrozyną, przez immunobarwienie przy użyciu przeciwciała anty-3-nitrotyroksyny (Upstate Biotechnology, Lake Placid, New York, USA) według producenta . S instrukcje (26. 28). Skrawki tkanki poddano deparafinizacji i endogenne nadtlenki zatrzymano przez dodanie 3% nadtlenku wodoru w PBS. Pozytywne kontrole inkubowano z mM egzogennego peroksynitrytu przez 10 minut. Skrawki najpierw inkubowano z 8% BSA (czynnikiem blokującym) przez 30 minut, następnie z poliklonalnym przeciwciałem króliczym a-nitrotirozyny (Upstate Biotechnology) przy 4 ug / ml przez godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie kozim anty-króliczym Przeciwciało IgG sprzężone z peroksydazą 3-3 P-diaminobenzydyny (DAB) (Vector Laboratories). Obecność nitrotyrozyny wykryto przez barwienie DAB. Analiza danych. Ciągłe dane wyrażono jako średnie. SEM. W celu porównania różnic między grupami dla zmiennych ciągłych zastosowano testy ucznia. Zastosowano dwuczynnikową ANOVA w celu zbadania różnic w odpowiedzi na dawkę dla agonistów między grupami, z analizą post hoc przeprowadzoną metodą Studenta-Newmana-Keulsa. Istotność statystyczna została zdefiniowana jako wartość P mniejsza niż 0,05. Wyniki Homocysty (e) stężenia i aktywność CBS. Aby scharakteryzować myszy CBSa / + i porównać je z myszami CBS + / +, zmierzono stężenie homocysty (e) w osoczu krwi i wątrobową aktywność CBS. Stwierdzono ponad dwukrotny wzrost losowego całkowitego stężenia homocysteiny w osoczu u myszy CBSA / + w porównaniu z myszami CBS + / + (P <0,05) (Figura 1a). Odpowiednio do tej różnicy, zaobserwowano około 50% zmniejszenie aktywności CBS z surowych ekstraktów wątroby u myszy CBSa / + w porównaniu z myszami CBS + / + (P <0,05) (Figura 1b). Te odkrycia potwierdzają fenotypową ekspresję częściowego niedoboru CBS i łagodnej hiperhomocysty (e) u myszy z heterozygotycznym rozerwaniem genu CBS. Figura (a) Całkowite stężenie homocysteiny w osoczu myszy CBS + / + (n = 5) i myszy C / P (n = 7) i (b) aktywność CBS z homogenatów wątroby w myszach CBS + / + (n = 6) i myszy CBSc / + (n = 6). AP <0,05. Relaksacja aortalna. Acetylocholina i nitroprusydek sodu powodowały zależne od dawki rozluźnienie w przedrakturowanych pierścieniach aortalnych u myszy CBS a / + i CBS + / + [podobne: laserowe usuwanie zylakow, zioła na odchudzanie ojca klimuszko, jak sobie poradzić po rozstaniu ] [podobne: aparat ortodontyczny na raty, urolog dziecięcy rzeszów, jak sobie poradzić po rozstaniu ]