Skip to content

Dysfunkcja śródbłonka w mysim modelu łagodnej hiperhomocysty (e) ad

1 tydzień ago

448 words

Ostatnio znaczenie tworzenia ponadtlenku zostało podkreślone przez osłabienie indukowanej przez homocysteinę dysfunkcji śródbłonka przez dysmutazę ponadtlenkową (9). Ponadto wykazano, że przeciwutleniaczowy kwas askorbinowy łagodzi upośledzenie funkcji wazodylatacyjnej zależnej od śródbłonka po prowokacji metioniną u ludzi (18). Model łagodnej hiperhomocysty (e) z powodu heterozygotycznego niedoboru CBS został opracowany przez celowe zakłócanie genów u myszy przez Watanabe a i współpracowników (19). Ten model jest bardzo przydatny do oceny specyficznych niekorzystnych skutków naczyniowych homocyst (e) ine; Badania na ludziach cierpią z powodu mylących skutków innych czynników ryzyka i szczerej miażdżycy (11. 13), a badaniom diety z niedoborem witamin u naczelnych mogą towarzyszyć inne efekty stanów niedoboru witaminy, które modulują funkcje naczyniowe (10). W niniejszym badaniu staraliśmy się zbadać wpływ łagodnej hiperhomocysty (e) na czynność naczyń. W szczególności zbadaliśmy wpływ łagodnej hiperhomocysty (e) na zależną od śródbłonka i niezależną funkcję rozszerzającą naczynia krwionośne. Ponadto, zmierzyliśmy markery stresu oksydacyjnego, aby uzyskać poparcie dla hipotezy, że łagodne zwiększenie homocysty (e) powoduje obciążenie utleniacza, które przyczynia się do jego szkodliwego wpływu na śródbłonek naczyniowy poprzez zmniejszenie dostępności bioaktywnego tlenku azotu. Metody Materiały i zwierzęta. Acetylocholina, metacholina, bradykinina, A23187 i nitroprusydek sodu otrzymano z Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA). Myszy heterozygotyczne pod względem rozerwania w genie CBS zostały dostarczone przez N. Maedę z University of North Carolina (Chapel Hill, Karolina Północna, USA), a następnie zostały wyhodowane w naszej instytucji. CBS został inaktywowany przy użyciu rekombinacji homologicznej w mysich embrionalnych komórkach macierzystych w celu przerwania sekwencji kodującej genu CBS, jak opisano wcześniej (19). Myszy z niedoborem Heterozygotów (a / +) CBS i miotu z grupy kontrolnej typu dzikiego (+ / +) stosowano w wieku 10. 20 tygodni w doświadczeniach oceniających czynność naczyń. Zwierzęta karmiono standardową karmą i postępowano zgodnie z wytycznymi NIH. Procedury zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee w Boston University Medical Center. Określenie genotypu. Biopsje ogona uzyskano od myszy w wieku 3 4 tygodni i homogenizowano stosując mg / ml proteinazę K, 1,0% SDS i bufor zawierający 0,1 mola / litr EDTA (pH 8,0), 0,05 mol / litr Tris (pH 8,5). ) i 0,2 mol / L NaCl. DNA wyekstrahowano alkoholem fenol / chloroform / izoamyl, wytrącono i przepłukano etanolem i zamplifikowano za pomocą PCR dla sekwencji w intronie 3 i wstawki Neo w myszach CBSA / + (19). Produkt przeprowadzono na 1% żelu agarozowym, a myszy CBSc / + zidentyfikowano dwoma pasmami o różnej ruchliwości elektroforetycznej. Określenie fenotypu: poziom homocysteiny i aktywność CBS. Krew pobrano od myszy w momencie uśmiercenia i zebrano w probówkach zawierających EDTA lub cytrynian. Osocze otrzymano przez odwirowanie i przechowywano w temperaturze <80 ° C. Całkowity homocyst osocza (e) ine mierzono metodą HPLC z detekcją elektrochemiczną z użyciem dostępnego w handlu zestawu (Bioanalytical Systems, Inc., West Lafayette, Indiana, USA). Wątroby zebrano od myszy w momencie uśmiercenia, szybko zamrożono i przechowywano w temperaturze <80 ° C. Aktywność CBS mierzono z surowych ekstraktów wątrobowych metodą Kashiwamata i Greenberg (20). Test opiera się na przesunięciu widma absorpcyjnego odczynnika ninhydrynowego po reakcji z cystationiną wytworzoną z jej prekursorów przez a-syntezę cystationiny. Aktywność enzymu wyrażono jako jednostki (mikromole utworzonej cystationiny na godzinę) na miligram białka. Przygotowanie pierścienia naczyniowego. Relaksację naczyniową w izolowanych pierścieniach aortalnych mierzono za pomocą izograficznego miografu. Myszy znieczulano ketaminą i ksylazyną (odpowiednio 40 i 8 mg / kg), a następnie zebrano torbielowatą aortę i natychmiast umieszczono na zmrożonym buforze Krebsa o następującym składzie jonowym: 188,3 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3 i 12 mM glukozy. Usunięto tkankę łączną przydanki i dwa 3-milimetrowe pierścienie wycięto w sposób ciągły z proksymalnie zstępującej aorty piersiowej. Pierścienie zostały zamontowane w poziomym myślowcu Kent z przetwornikiem siły (Kent Scientific Co., Litchfield, Connecticut, USA) w celu pomiaru napięć izometrycznych. Pierścienie utrzymywano w buforze Krebsa w 37 ° C i napowietrzano przy użyciu 95% O2 ~ 5% CO2. Całkowite napięcie spoczynkowe 2,5. 2,8 g zastosowano stopniowo, a pierścień pozostawiono do osiągnięcia równowagi przez 60 minut [przypisy: piłka do siedzenia przy biurku, olejek arganowy gdzie kupić, techniki relaksacyjne dla dzieci ] [patrz też: marek kamiński blog, poradnia osteoporozy warszawa, bestia z wolfsberga cda ]