Skip to content

Białka surfaktantowe A i D chronią myszy przed nadwrażliwością płuc indukowaną przez antygeny i alergeny Aspergillus fumigatus ad

2 miesiące ago

708 words

Nasze wyniki silnie wskazują na udział SP-A i SP-D w ochronie przed reakcjami odpornościowymi, w których pośredniczy alergen. Metody Myszy. Myszy BALB / c, wolne od określonych czynników chorobotwórczych, w wieku od 6 do 8 tygodni uzyskano z Narodowego Centrum Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (National Institute of Nutrition, Indyjska Rada Badań Medycznych, Jamai-Osmania, Hyderabad, Indie) i Harlan -OLAC, Shaw. S Farm (Bicester, Oxfordshire, Wielka Brytania). Otrzymali Purina chow i zakwaszoną wodę ad libitum. Myszy randomizowano przed przeprowadzeniem eksperymentów. Antygeny. Do uwrażliwienia myszy użyto 3wcf (frakcja antygenowa wzbogacona w białko, 27 mg / ml) Afu (szczep 285, wyizolowany z plwociny pacjenta ABPA odwiedzającego Instytut klatki piersiowej V. Patel, Delhi, Indie). Antygeny filtratu hodowli przygotowano przez hodowanie organizmu w bulionie syntetycznym (pożywka L-asparagina) przez 3 tygodnie w 37 ° C w hodowli stacjonarnej. Grzyby usunięto przez odsączenie, a przesącz intensywnie dializowano wobec wody destylowanej, a następnie strącano siarczanem amonu i liofilizowano. Preparat antygenowy charakteryzował się 15% (wag./obj.) SDS-PAGE i jego reaktywnością z łączonymi pacjentami. Surowice badano przy użyciu testu ELISA i analizy Western blot. Surowice ludzkie. Pacjenci ABPA. SERA użyte w badaniu uzyskano z klinicznie potwierdzonych przypadków (spełniających kryteria Rosenberga) zarejestrowanych w V. Patel Chest Institute. Surowica, uzyskana od zdrowych, zgodnych dawców bez choroby płuc, była stosowana jako kontrola. Przygotowanie natywnych ludzkich SP-A i SP-D. Natywny ludzki SP-A i SP-D oczyszczono z płukania płuc uzyskanego od pacjentów z białaczką pęcherzykową, jak opisano wcześniej (13), i oceniono, że są one czyste przy użyciu SDS-PAGE (Figura 1b), analizy Western i aminowej skład kwasowy. Stwierdzono, że są wolne od kontaminacji IgG, IgM i IgE testem ELISA, stosując, odpowiednio, koniugaty anty-ludzkie IgG, przeciwludzkie IgM i przeciw ludzkiemu IgE peroksydazy. Preparaty SP-A i SP-D badano także pod kątem poziomów endotoksyn przy użyciu systemu lizatu amebocytów Limulus QCL-1000 (BioWhittaker Inc., Walkersville, Maryland, USA). Test był liniowy w zakresie 0,1. 1,0 EU / ml (10 EU = ng endotoksyny). Stwierdzono, że ilość endotoksyny wynosiła 16 pg / g SP-A i 56 .g / .g SP-D. Figura (a) Analiza SDS-PAGE (15% wag / obj) oczyszczonych preparatów rSP-D w warunkach redukujących, jak również nieredukujących (barwienie Coomassie). Rekombinowany, homotrimeryczny fragment składający się z ośmiu powtórzeń Gly-Xaa-Yaa, a-helikalnego regionu zwojowo-zwojowej szyi i CRD ludzkiego SP-D eksprymowano w E. coli jako ciałka inkluzyjne i oczyszczono. Rekombinowane białko zachowywało się jak homotrimer około 60 kDa, gdy badano go metodą chromatografii żelowej i sieciowania chemicznego (dane nie pokazane). W warunkach redukujących (linia 2) działał jako monomer o około 18 kDa. Nie zaobserwowano wyższych oligomerów, gdy rSP-D był prowadzony w warunkach nieredukujących (ścieżka 3), potwierdzając, że trimeryzacja nie była wynikiem nieprawidłowych mostków dwusiarczkowych pomiędzy regionami CRD. RSP-D oceniano również pod kątem prawidłowego fałdowania z użyciem mapowania dwusiarczkowego, a jego struktura krystalograficzna skompleksowała się z maltozą w kieszeniach wiążących węglowodany (AK Shrive i wsp., Dane niepublikowane). (b) Analiza SDS-PAGE (10% wag / obj) oczyszczonych preparatów SP-D i SP-A w warunkach redukujących (barwienie Coomassie). Większość SP-D składa się z łańcucha polipeptydowego 43-kDa (linia 1) ze słabymi prążkami odpowiadającymi dimerom i trimerom łańcucha 43-kDa (potwierdzonym przez immunoblotting). Widoczne są dwa prążki, główny prążek odpowiadający łańcuchowi polipeptydowemu 32-kDa SP-A (linia 2), wraz z proporcją nieredukowalnych dimerów (64 kDa). Widoczne są również ślady wyższych oligomerów i niektórych agregatów (potwierdzonych przez immunoblotting). Nieredukowane preparaty SP-D i SP-A zachowywały się na SDS-PAGE jak opisano wcześniej (13). Ekspresja i oczyszczanie rSP-D. Rekombinowany homotrimer, składający się z ośmiu powtórzeń Gly-Xaa-Yaa z regionu kolagenu, P-helikalnego regionu szyjki zwojowej i CRD ludzkiego SP-D, wyrażono w Escherichia coli i oczyszczono za pomocą procedury obejmującej denaturację i renaturację ciałek inkluzyjnych, chromatografii jonowymiennej, powinowactwa i chromatografii żelowej. Rekombinowany preparat oceniono jako czysty, stosując SDS-PAGE (Figura 1a), immunoblotting i sekwencjonowanie końca aminowego. Oczyszczone rekombinowane białko oceniono pod względem prawidłowego fałdowania za pomocą mapowania dwusiarczku i jego struktury krystalograficznej skompleksowanej z maltozą w kieszeniach wiążących węglowodany (AK
[przypisy: ćwiczenia z hantlami na klate, zioła na odchudzanie ojca klimuszko, laserowe usuwanie zylakow ]
[patrz też: zostań rentierem opinie, sukces definicja, marek kamiński blog ]